Transplante ortotópico de longo prazo de células tumorais em embriões de peixe-zebra: um método eficiente para entregar células tumorais no quarto ventrículo de embriões de peixe-zebra para análise de longo prazo do comportamento das células tumorais

Durante o transplante ortotópico, células tumorais ou tecidos de um doador portador de tumor são transplantados para o tecido correspondente de um receptor da mesma espécie. Primeiro, prepare uma suspensão uniforme - em um tampão adequado - de células tumorais cerebrais marcadas com fluorescência colhidas de um peixe-zebra portador de tumor. Usando uma ponta de carregamento de gel fino, carregue esta suspensão celular em uma agulha de microinjeção.

Em seguida, prenda a agulha carregada no suporte de um micromanipulador. Posteriormente, transfira um embrião de peixe-zebra anestesiado para uma placa de injeção pré-fabricada. Para facilitar o acesso durante a microinjeção, posicione o embrião lateralmente para visualizar os ventrículos cerebrais - uma rede de cavidades cheias de líquido cefalorraquidiano dentro do cérebro.

Ajuste a ponta da agulha para injetar a suspensão de células tumorais no quarto ventrículo, a cavidade em forma de diamante do rombencéfalo do embrião. As células tumorais ocupam o espaço oco dentro do ventrículo. Retraia a agulha. Transfira o embrião para uma placa de cultura contendo solução salina. Observe o embrião sob um estereomicroscópio de fluorescência para confirmar a presença de células tumorais no espaço ventricular.

Incube o embrião. Poucas horas após a injeção, as células tumorais migram e invadem o tecido cerebral circundante, onde proliferam dando origem a novos tumores. Com o tempo, as células tumorais proliferam e invadem ainda mais, espalhando-se por todo o cérebro.

Usando uma pipeta de transferência, transfira de 10 a 20 embriões anestesiados para a periferia da placa de injeção. Os embriões devem cair lateralmente com os ventrículos claramente visíveis e acessíveis. Use uma sonda angular para ajustar os embriões conforme necessário e posicione-os longe da borda externa da placa de injeção.

Em seguida, use uma ponta de carregamento de gel para carregar 1 a 2 microlitros da suspensão de células tumorais na agulha de injeção e insira a agulha no manipulador. Em seguida, abaixe manualmente o manipulador, segurando a agulha em um ângulo de 45 graus. Ajuste os botões do micromanipulador nas direções x, y e z até que a agulha esteja logo acima e aproximadamente 5 milímetros à direita da cabeça do embrião.

Usando um estereomicroscópio, ajuste lentamente o micromanipulador na direção x até que a agulha perfure o quarto ventrículo do embrião. Não permita que a agulha perfure o coração ou a gema. Para injeções consistentes, os embriões devem ser anestesiados. O tumor deve ser devidamente dissociado em uma suspensão celular e a agulha deve perfurar o quarto ventrículo, mas não se estender além do coração.

Empurre o pedal do microinjetor para injetar a suspensão de células tumorais. Quando terminar de injetar, use água fresca com ovo para enxaguar suavemente os embriões injetados da placa de injeção e colocá-los em uma placa de Petri. Agora, inspecione os embriões injetados sob um estereomicroscópio de fluorescência em uma sala escura. Confirme se a pressão de injeção, o ângulo, o tamanho da agulha e a viscosidade da suspensão celular resultam em células tumorais preenchendo 25% a 50% do espaço ventricular.

Coloque os embriões de volta na incubadora de 28 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, avalie a sobrevivência do embrião examinando características morfológicas e fisiológicas, como o desenvolvimento normal do coração e do cérebro, conforme descrito anteriormente.