Indução de glioblastoma usando transposição mediada por SB: uma técnica para gerar um novo modelo de camundongo usando integração mediada por transposon do plasmídeo SB no cérebro de camundongo neonatal

Comece pegando um tubo contendo uma mistura de plasmídeos. A bela adormecida ou plasmídeo de transposon SB é projetado para transportar um elemento transponível que compreende um oncogene indutor de glioblastoma derivado de humanos imprensado entre duas sequências repetidas invertidas. Além disso, esta mistura contém um plasmídeo SB transposase que possui um elemento de expressão da enzima transposase.

Agora, adicione um reagente de transfecção adequado ao tubo. Aspire a mistura para injeção em uma seringa equipada com uma microagulha. Em seguida, prenda um filhote de camundongo anestesiado na posição de bruços em uma estrutura estereotáxica. Visualize a região da cabeça do filhote para localizar as suturas cranianas. Posicione a microagulha acima das suturas cranianas.

Injete a mistura no ventrículo lateral - uma cavidade dentro do parênquima cerebral. Posteriormente, a solução é dispersa no parênquima cerebral, onde as moléculas reagentes de transfecção facilitam a entrada de plasmídeos dentro das células. Uma vez dentro da célula, o plasmídeo da transposase expressa as moléculas da enzima transposase, que reconhecem as sequências repetidas invertidas e extirpam o elemento transposon.

O DNA do elemento transponível então se reintegra na região de repetição TA do DNA genômico do filhote. A transposição genética resulta em uma transformação oncogênica das células cerebrais, levando ao desenvolvimento de glioblastoma no cérebro do camundongo.

3 a 4 semanas antes do experimento, monte uma gaiola de reprodução de camundongos com um macho e uma fêmea. Inclua um iglu de plástico colorido para enriquecer o ambiente e aumentar as chances de acasalamento. Remova o macho assim que a gravidez for confirmada e, 18 dias após o dia do acasalamento, comece a monitorar a fêmea para o parto. Certifique-se de que uma mãe de aluguel esteja disponível no momento do parto.

No primeiro dia pós-natal, realize as injeções intraventriculares. Preparar a solução injectável aliquotando primeiro 20 microlitros da mistura de ADN que contém os plasmídeos de transposões a uma concentração final de 0,5 microgramas de ADN por microlitro. Em seguida, adicione uma alíquota de 20 microlitros de solução de PEI à solução de DNA e deixe-os incubar em temperatura ambiente por 20 minutos a uma hora, após o que a mistura deve ser armazenada no gelo.

Para a agulha de injeção, conecte uma seringa de 10 microlitros a uma agulha hipodérmica de calibre 30 chanfrada a 12,5 graus. Em seguida, coloque a seringa a uma bomba com injeção automática. Teste a configuração com 10 microlitros de água e certifique-se de esvaziar a seringa. Agora, resfrie o estágio estereotáxico neonatal com uma pasta de gelo seco e álcool. Quando estiver resfriado entre 2 e 8 graus Celsius, prossiga com as injeções.

Anestesie um filhote colocando-o no gelo por 2 minutos. Enquanto o filhote estiver no gelo, carregue a seringa com a solução injetável. Uma vez anestesiado, transfira o filhote para a armação e imobilize sua cabeça entre as barras auriculares cobertas de gaze. Verifique se o lado dorsal do crânio é horizontal e paralelo à superfície da armação. Além disso, as suturas cranianas devem ser claramente visíveis.

Se a cabeça do filhote não for imobilizada com firmeza suficiente, ela se moverá durante a injeção, enquanto se for espremida com muita firmeza entre as barras auriculares da armação, o lambda não será visível e a pressão dentro da cabeça forçará a solução injetada a vazar.

Com o filhote agarrado firmemente pela estrutura, limpe a cabeça com etanol 70%. Em seguida, abaixe a agulha e ajuste sua posição para que ela entre em contato com o lambda. Em seguida, levante a agulha e mova-a 0,8 milímetros lateralmente e 1,5 milímetros rostalmente. Em seguida, abaixe-o novamente até que faça covinhas leves na pele. Registre as coordenadas desta posição. Em seguida, abaixe a agulha 1,5 milímetros através da pele e do crânio e no córtex no ventrículo lateral.

Lá, injete 0,75 microlitros em 90 segundos e espere um minuto para que a solução se disperse. Enquanto espera, o próximo filhote a ser injetado pode ser anestesiado. Após a espera, levante lentamente a agulha. Em seguida, transfira o filhote para um local de recuperação sob uma lâmpada de aquecimento. O tempo desde a anestesia até o aquecimento deve ser inferior a 10 minutos; quanto mais rápido, melhor.

Monitore sua respiração e, se necessário, esfregue suavemente os membros para estimular a respiração. Assim que o filhote estiver aquecido, tiver uma cor rosada e respiração constante, devolva-o à mãe.