Isolando vasos cerebrais de camundongos: um protocolo para isolar vasos intactos de amostras de cérebro murino

Os vasos cerebrais são cercados por uma camada de células endoteliais fortemente conectadas. Essas células têm uma membrana basal ao seu redor, juntamente com componentes celulares, como pericitos e astrócitos.

Para isolar os vasos cerebrais dos neurônios e células gliais circundantes, pegue um béquer contendo cérebro de camundongo submerso em um tampão de homogeneização. Pique em pedaços pequenos. Homogeneizar o tecido cerebral para dissociá-lo, liberando neurônios, células gliais e vasos cerebrais. Este tratamento também interrompe a bainha de mielina ao redor dos neurônios.

Transfira o homogeneizado para um tubo e centrifugue para peletizar os recipientes. Os componentes mais leves, como neurônios e células gliais, permanecem no sobrenadante, enquanto a mielina forma uma densa camada de interface ao redor do pellet.

Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento do recipiente com a camada de mielina anexada num meio de gradiente de densidade adequado. Centrifugue para peletar os vasos e obtenha uma faixa de mielina rica em gordura flutuando no topo do sobrenadante. Remova a banda de mielina junto com o meio gasto e ressuspenda o pellet em um novo tampão.

Coe a preparação do recipiente bruto usando um conjunto de filtro contendo um filtro pequeno o suficiente para que os recipientes não possam passar por ele. Transferir o filtro para um novo copo contendo uma solução-tampão. Raspe suavemente o papel de filtro para soltar os recipientes e guarde-os para análise posterior.

Use um bisturi para incisar a pele do pescoço do camundongo até o nariz e puxe a pele para trás. Lave o crânio com PBS para remover quaisquer pêlos contaminantes e, em seguida, insira uma tesoura no crânio, anterior aos bulbos olfatórios. Abra a tesoura para romper o crânio em duas partes e remova o cérebro com uma espátula.

Em seguida, disseque o plexo coróide dos ventrículos laterais e transfira o cérebro para um béquer de 150 mililitros contendo 20 mililitros de solução B1 no gelo. Em seguida, use dois bisturis para cortar vigorosamente o cérebro em fragmentos de tecido de 2 milímetros e use um homogeneizador Dounce automatizado para homogeneizar o tecido por 20 golpes a 400 rpm no gelo.

Para purificar os recipientes, transfira o homogeneizado para um tubo de plástico de 50 mililitros e gire a pasta de tecido em uma centrífuga de rotor oscilante. Uma grande interface branca consistindo principalmente de mielina se formará na parte superior do pellet do vaso. Descarte o sobrenadante.

Adicione 20 mililitros de solução B2 gelada e agite o tubo vigorosamente por 1 minuto. Após uma segunda centrifugação, a mielina formará uma camada branca densa na superfície do sobrenadante. Gire lentamente o tubo para permitir que a solução B2 escorra ao longo da parede à medida que é derramada e descarte a mielina com o sobrenadante.

Em seguida, use uma pipeta de plástico embrulhada em papel absorvente para remover qualquer fluido residual das paredes do tubo, tomando cuidado para não tocar no pellet do recipiente, e vire o tubo de cabeça para baixo no gelo. Em seguida, ressuspenda o pellet em 1 mililitro de solução B3 gelada, seguido da adição de mais 5 mililitros de solução B3, tomando cuidado para que os vasos não formem agregados.

Agora, coloque um filtro de malha de náilon de 20 mícrons em cima de um frasco de Becker e equilibre o filtro com 10 mililitros de solução B3 gelada. Despeje a preparação do recipiente no filtro e enxágue cuidadosamente os recipientes com mais 40 mililitros de solução B3 gelada.

Em seguida, use uma pinça limpa para transferir imediatamente o filtro para um béquer contendo 30 mililitros de solução B3 fresca e conecte os recipientes do filtro com uma agitação suave. Despeje o conteúdo do béquer em um tubo de plástico de 50 mililitros. Em seguida, após uma centrifugação, ressuspenda o pellet em 1 mililitro de solução B3 gelada.