Dissecção do cerebelo e preparação de fatias: um método para gerar fatias de tecido a partir de cerebelo de camundongo

Em camundongos, o cerebelo está situado na base do prosencéfalo e consiste em dois hemisférios laterais unidos por uma linha média - vermis. O cerebelo, que contém a maioria dos neurônios do cérebro, é vital para estudos neurológicos.

Para gerar fatias de cerebelo, comece com uma cabeça de rato decapitada. Insira uma tesoura no forame magno - a abertura na base do crânio. Incise suavemente o crânio e remova-o. Em seguida, vire o cérebro e corte os nervos óptico e trigêmeo. Solte o cérebro em um meio de dissecação resfriado com o lado dorsal para cima. Separe o rombencéfalo das outras partes do cérebro.

Em seguida, corte os pedúnculos cerebelares subjacentes - a conexão entre o cerebelo e o tronco cerebral - para separar o cerebelo. Remova as meninges do cerebelo. Coloque cuidadosamente o cerebelo em uma plataforma picadora de tecidos perpendicular à lâmina picadora. Agora, disseque as fatias de tecido de espessura apropriada. Molhe imediatamente as fatias e transfira-as de volta para a placa de Petri contendo o meio de dissecação.

Separe e identifique as fatias do vermis. Transfira as fatias selecionadas para um recipiente de encaixe em uma placa de cultura contendo um meio de cultura adequado. Incubar a cultura para manter a integridade estrutural e funcional das fatias cerebelares dissecadas para experimentos posteriores.

Para começar, insira uma pequena tesoura suavemente no forame magno e corte o crânio fazendo uma incisão lateral para o lado e, em seguida, corte ao redor da cabeça do crânio. Para recuperar a parte dorsal do crânio, use uma pinça reta fina para levantar cuidadosamente a parte dorsal do crânio.

Em seguida, introduza cuidadosamente a pinça entre o crânio ventral e o cérebro. Gentilmente, vire o cérebro e corte os nervos óptico e trigêmeo com uma tesoura pequena. Em seguida, vire a cabeça ou a parte dorsal do crânio de cabeça para baixo, logo acima de uma placa de cultura de células de 60 milímetros contendo meio de dissecação gelada para ajudar o cérebro a cair por gravidade.

Usando uma pinça fina, oriente o cérebro com o lado dorsal voltado para cima e o lado ventral deitado. Sob o microscópio binocular, use a pinça reta fina para imobilizar o cérebro no lado do prosencéfalo. Em seguida, separe o rombencéfalo do resto do cérebro. Corte os pedúnculos cerebelares sob o cerebelo para separar o cerebelo do resto do rombencéfalo.

Uma vez isolado o cerebelo, use uma pinça reta fina para arrancar cuidadosamente as meninges. Segure o cerebelo suavemente com a pinça curva fina e coloque-o com o lado dorsal para cima na plataforma de plástico perpendicular à lâmina de barbear do picador. Em seguida, com uma ponta de pipeta de ponta fina estéril conectada a uma pipeta de 1 mililitro, aspire qualquer excesso de meio de dissecção ao redor do cerebelo. Em seguida, com um cortador de tecido, cortes sagitais de 300 micrômetros de espessura do cerebelo.

Em seguida, adicione uma gota de meio de dissecção no cerebelo fatiado suavemente. Em seguida, com uma ponta de pipeta de calibre largo conectada à pipeta de 1 mililitro, aspire lentamente o cerebelo fatiado e transfira-o de volta para a placa de cultura de células de 60 milímetros contendo meio de dissecção gelado.

Em seguida, use duas pinças retas finas para separar as fatias individuais. Em seguida, com uma ponta de pipeta de diâmetro largo conectada à pipeta de 1 mililitro, transfira até quatro fatias selecionadas do vermis junto com um meio de dissecção para uma inserção de cultura de uma placa de 6 poços. Remova qualquer excesso de meio de dissecção ao redor das fatias usando uma ponta de pipeta de ponta fina.