Eletroporação de célula única em culturas organotípicas de fatias cerebrais: uma técnica in vitro para entregar plasmídeos dentro de neurônios-alvo em fatias cerebrais do hipocampo

Comece a eletroporação pegando uma pipeta de vidro contendo a solução de plasmídeo desejada. Conecte-o a um suporte de micropipeta equipado com um eletrodo de fio de prata, garantindo que o eletrodo seja inserido na micropipeta. Pegue uma câmara de eletroporação contendo uma seção ultrafina do hipocampo submersa em líquido cefalorraquidiano artificial.

Mergulhe o eletrodo de aterramento no fluido presente na câmara para eletroporação subsequente. Abaixe a ponta da pipeta na câmara de eletroporação e registre a resistência da linha de base. Use um microscópio para posicionar a ponta da pipeta perto da célula-alvo. Uma vez que a pipeta está em contato com a membrana neuronal, sua resistência aumenta drasticamente.

Aplique pressão de ar positiva para criar uma pequena invaginação na membrana neuronal. Aplique rapidamente uma sucção suave para empurrar a membrana para cima, criando uma vedação solta entre a ponta da pipeta e a membrana. Repita esse processo mais algumas vezes para condicionar a membrana e evitar a lise celular.

Após o condicionamento, aplique uma forte sucção para formar uma vedação firme com uma membrana chamada vedação gigaohm. Use pulsos elétricos para formar poros transitórios na área selada da membrana. Essas aberturas facilitam a entrada de plasmídeos dentro do neurônio alvo. Após a eletroporação, os poros se fecham novamente, prendendo plasmídeos dentro do neurônio.

Para preparar culturas de fatias para eletroporação, transfira as inserções de cultura de interesse para placas de Petri individuais de 3 centímetros carregadas com 900 microlitros de meio de cultura e coloque as culturas em uma incubadora de dióxido de carbono de mesa. Em seguida, pré-incube as inserções de cultura fresca com 1 mililitro de meio de cultura por fatia por inserção em uma placa de Petri de 3,5 centímetros por pelo menos 30 minutos e esterilize as linhas da plataforma de eletroporação com alvejante a 10% por 5 minutos.

No final da perfusão, enxágue as linhas com água ionizada autoclavada por pelo menos 30 minutos antes de perfundir com aCSF esterilizado por filtro contendo 0,001 milimolar tetrodotoxina. Defina o pulso do eletroporador para uma amplitude de menos 5 volts, um pulso quadrado, um trem de 500 milissegundos, uma frequência de 50 Hertz e uma largura de pulso de 500 microssegundos. Encha uma pipeta de vidro com 5 microlitros de solução interna contendo plasmídeo e bata suavemente na ponta várias vezes para remover quaisquer bolhas presas.

Use um microscópio de dissecção para confirmar se a ponta não está danificada e prenda firmemente a ponta da pipeta ao eletrodo. Quando a ponteira entrar em contato com o aCSF, registre a leitura da resistência da pipeta do eletroporador. Para isolar uma cultura de fatia, corte a membrana do inserto de cultura com uma lâmina afiada e use uma pinça de ângulo agudo para transferir cuidadosamente a cultura de fatias para a câmara de eletroporação. Em seguida, fixe a posição da cultura com uma âncora de fatia.

Para eletroporação das células de interesse, aplique pressão positiva na pipeta por via oral e use os controles tridimensionais do botão para manobrar a ponta da pipeta para perto da superfície da cultura de fatias. Visualizando a cultura com o microscópio, aproxime-se da célula-alvo com a ponta, mantendo a pressão positiva aplicada até que uma covinha se forme na superfície da célula. Após a visualização da covinha, aplique rapidamente uma leve pressão negativa por via oral para que uma vedação solta se forme entre a ponta da pipeta e a membrana plasmática.

A membrana entrará ligeiramente na pipeta. Deve-se observar um aumento de aproximadamente 2,5x na resistência inicial da pipeta, conforme indicado pelo aumento do tom dos alto-falantes. Reaplique rapidamente a pressão positiva para que a covinha se reforme. Em seguida, complete imediatamente pelo menos mais dois ciclos de pressão, conforme demonstrado, sem pausa. Após o último pulso de pressão, mantenha a pressão negativa por 1 segundo. O tom dos alto-falantes atinge um ápice estável no tom. Use o pedal para pulsar rapidamente o eletroporador.

Após a eletroporação, retraia suavemente a pipeta aproximadamente 100 mícrons da célula sem aplicar pressão e reaplique a pressão positiva, verificando se a resistência é semelhante à leitura da linha de base antes de se aproximar da próxima célula. Quando todas as células de interesse tiverem sido eletroporadas, transfira a cultura de fatias para uma das pastilhas de cultura fresca preparadas e coloque a pastilha a 35 graus Celsius por até 3 dias.