Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Pesquisa sobre o Câncer
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[INSIRA FIGURE1 AQUI]
Figura 1: Coluna vertebral dissecada e medula espinhal liberada de um camundongo neonatal de 3 dias de idade. A seta em (a) aponta para a extremidade caudal da coluna, onde uma agulha é inserida para liberar a medula espinhal. Uma medula espinhal liberada (b) é mostrada submersa em PBS.
[INSIRA FIGURE2 AQUI]
Figura 2: Gradiente de densidade, com células adicionadas após centrifugação. As cama
Para isolar os neurônios da medula espinhal, pegue uma coluna vertebral de um camundongo neonatal e coloque-a em uma placa de Petri. Lave a coluna vertebral com tampão salino para liberar a medula espinhal. Transfira a medula espinhal para o meio neuronal frio para promover a sobrevivência celular.
Em seguida, pique a medula espinhal e transfira os fragmentos para um tubo contendo meio neuronal fresco. Incube o tubo em banho-maria agitador para aclimatação. Após a incubação, remova o meio gasto e adicione o meio de digestão. As enzimas digestivas clivam a matriz tecidual para soltar as células.
Realize a trituração aspirando os fragmentos de tecido para dentro da pipeta e esvazie rapidamente os componentes, liberando células individuais em suspensão. Em seguida, transfira esta suspensão para um tubo contendo meio gradiente de densidade e centrífuga.
Após a centrifugação, a camada superficial do tubo contém detritos de tecido. A primeira camada inclui oligodendrócitos e astrócitos. A segunda e a terceira camadas compreendem os neurônios, com a terceira camada tendo a maior pureza. Por último, o pellet contém células microgliais.
Colete a terceira camada em um tubo novo e adicione meio neuronal para diluir o meio gradiente de densidade. Centrifugue para peletizar os neurônios. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em um meio neurobasal para preservar os neurônios para experimentos futuros.
Para iniciar este procedimento, separe a cabeça do corpo dos filhotes de camundongos sacrificados usando uma tesoura. Em seguida, estabilize a cauda e os braços na mesa de procedimentos com o lado dorsal voltado para cima. Em seguida, corte a pele usando a tesoura de íris curva. Depois disso, corte a medula espinhal da região lombar logo acima dos quadris e, em seguida, corte os dois lados do tórax para separá-lo do corpo.
Lave as amostras sequencialmente em três placas de Petri de 10 centímetros contendo 5 mililitros de PBS esterilizado por 10 segundos cada para remover o excesso de tecido. Em seguida, insira uma agulha de calibre 22 e uma seringa cheia de 5 mililitros de PBS esterilizado na extremidade caudal da coluna vertebral e lave cranialmente, permitindo que o cordão saia para uma quarta placa de Petri.
Transfira a medula espinhal em um tubo de 15 mililitros com 5 mililitros de HABG no gelo. Evite esmagar a medula espinhal e repita os procedimentos para o resto dos filhotes. Idealmente, esse processo não deve levar mais de 30 minutos para um grupo de filhotes para garantir o isolamento saudável dos neurônios.
Para preparar o gradiente de densidade, prepare cada uma das quatro camadas em quatro tubos de 15 mililitros. Em seguida, adicione 1 mililitro de cada camada em um novo tubo de 15 mililitros. Comece com a camada 1 na parte inferior e adicione sequencialmente até atingir a camada 4 na parte superior. Evite perturbar as camadas durante a adição e quaisquer movimentos vigorosos que possam causar mistura. Em seguida, adicione o meio de digestão ao tecido picado. Colocar a amostra num shaker em banho-maria a 30 graus Celsius. Depois, retire o lenço do banho-maria e deixe-o repousar por alguns minutos.
Para realizar a trituração, aspire o excesso de meio de digestão. Suspenda o tecido em 2 mililitros de HABG. Usando uma pipeta de diâmetro estreito, triture 10 vezes em 45 segundos e evite a introdução de ar, pois isso diminuirá significativamente o rendimento viável. A trituração é uma das etapas mais críticas do procedimento. O tecido deve ser cuidadosamente aspirado e esvaziado da pipeta polida a fogo, evitando o excesso de vigor, que pode levar à morte neuronal, ou ser muito suave, o que resultará em um baixo rendimento.
Em seguida, aspire os 2 mililitros superiores do sobrenadante e transfira-o para um novo tubo de 15 mililitros rotulado como "coleção". Repita os procedimentos de coleta mais duas vezes para obter 6 mililitros de sobrenadante. Em seguida, transfira lentamente o conteúdo do tubo de coleta para o tubo gradiente preparado anteriormente, evitando a interrupção do gradiente.
Para purificar os neurônios, centrifugue o tubo gradiente por 15 minutos a 800 x g e 22 graus Celsius. Colete as camadas desejadas e transfira-as em um novo tubo de 15 mililitros. Para obter o isolamento de neurônios de maior pureza, colete a camada 3. Para obter mais rendimento com menos pureza, colete as camadas 2 a 3.
Em seguida, dilua o gradiente de densidade adicionando 5 mililitros de HABG às camadas recém-coletadas. Centrifugue-o a 200 x g por 2 minutos a 22 graus Celsius. Após 2 minutos, rejeitar o sobrenadante e ressuspender as células em 5 mililitros de HABG agitando o sedimento. Em seguida, centrifugue novamente a amostra a 200 x g durante 2 minutos a 22 graus Celsius. Em seguida, descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em 3 mililitros de meio neurobasal sacudindo o pellet.