Isolamento de neurônios da medula espinhal: um procedimento de gradiente de densidade para isolar neurônios neonatais da medula espinhal para estudos in vitro

Para isolar os neurônios da medula espinhal, pegue uma coluna vertebral de um camundongo neonatal e coloque-a em uma placa de Petri. Lave a coluna vertebral com tampão salino para liberar a medula espinhal. Transfira a medula espinhal para o meio neuronal frio para promover a sobrevivência celular.

Em seguida, pique a medula espinhal e transfira os fragmentos para um tubo contendo meio neuronal fresco. Incube o tubo em banho-maria agitador para aclimatação. Após a incubação, remova o meio gasto e adicione o meio de digestão. As enzimas digestivas clivam a matriz tecidual para soltar as células.

Realize a trituração aspirando os fragmentos de tecido para dentro da pipeta e esvazie rapidamente os componentes, liberando células individuais em suspensão. Em seguida, transfira esta suspensão para um tubo contendo meio gradiente de densidade e centrífuga.

Após a centrifugação, a camada superficial do tubo contém detritos de tecido. A primeira camada inclui oligodendrócitos e astrócitos. A segunda e a terceira camadas compreendem os neurônios, com a terceira camada tendo a maior pureza. Por último, o pellet contém células microgliais.

Colete a terceira camada em um tubo novo e adicione me