Isolamento de neurônios da medula espinhal: um procedimento de gradiente de densidade para isolar neurônios neonatais da medula espinhal para estudos in vitro

Para isolar os neurônios da medula espinhal, pegue uma coluna vertebral de um camundongo neonatal e coloque-a em uma placa de Petri. Lave a coluna vertebral com tampão salino para liberar a medula espinhal. Transfira a medula espinhal para o meio neuronal frio para promover a sobrevivência celular.

Em seguida, pique a medula espinhal e transfira os fragmentos para um tubo contendo meio neuronal fresco. Incube o tubo em banho-maria agitador para aclimatação. Após a incubação, remova o meio gasto e adicione o meio de digestão. As enzimas digestivas clivam a matriz tecidual para soltar as células.

Realize a trituração aspirando os fragmentos de tecido para dentro da pipeta e esvazie rapidamente os componentes, liberando células individuais em suspensão. Em seguida, transfira esta suspensão para um tubo contendo meio gradiente de densidade e centrífuga.

Após a centrifugação, a camada superficial do tubo contém detritos de tecido. A primeira camada inclui oligodendrócitos e astrócitos. A segunda e a terceira camadas compreendem os neurônios, com a terceira camada tendo a maior pureza. Por último, o pellet contém células microgliais.

Colete a terceira camada em um tubo novo e adicione meio neuronal para diluir o meio gradiente de densidade. Centrifugue para peletizar os neurônios. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em um meio neurobasal para preservar os neurônios para experimentos futuros.

Para iniciar este procedimento, separe a cabeça do corpo dos filhotes de camundongos sacrificados usando uma tesoura. Em seguida, estabilize a cauda e os braços na mesa de procedimentos com o lado dorsal voltado para cima. Em seguida, corte a pele usando a tesoura de íris curva. Depois disso, corte a medula espinhal da região lombar logo acima dos quadris e, em seguida, corte os dois lados do tórax para separá-lo do corpo.

Lave as amostras sequencialmente em três placas de Petri de 10 centímetros contendo 5 mililitros de PBS esterilizado por 10 segundos cada para remover o excesso de tecido. Em seguida, insira uma agulha de calibre 22 e uma seringa cheia de 5 mililitros de PBS esterilizado na extremidade caudal da coluna vertebral e lave cranialmente, permitindo que o cordão saia para uma quarta placa de Petri.

Transfira a medula espinhal em um tubo de 15 mililitros com 5 mililitros de HABG no gelo. Evite esmagar a medula espinhal e repita os procedimentos para o resto dos filhotes. Idealmente, esse processo não deve levar mais de 30 minutos para um grupo de filhotes para garantir o isolamento saudável dos neurônios.

Para preparar o gradiente de densidade, prepare cada uma das quatro camadas em quatro tubos de 15 mililitros. Em seguida, adicione 1 mililitro de cada camada em um novo tubo de 15 mililitros. Comece com a camada 1 na parte inferior e adicione sequencialmente até atingir a camada 4 na parte superior. Evite perturbar as camadas durante a adição e quaisquer movimentos vigorosos que possam causar mistura. Em seguida, adicione o meio de digestão ao tecido picado. Colocar a amostra num shaker em banho-maria a 30 graus Celsius. Depois, retire o lenço do banho-maria e deixe-o repousar por alguns minutos.

Para realizar a trituração, aspire o excesso de meio de digestão. Suspenda o tecido em 2 mililitros de HABG. Usando uma pipeta de diâmetro estreito, triture 10 vezes em 45 segundos e evite a introdução de ar, pois isso diminuirá significativamente o rendimento viável. A trituração é uma das etapas mais críticas do procedimento. O tecido deve ser cuidadosamente aspirado e esvaziado da pipeta polida a fogo, evitando o excesso de vigor, que pode levar à morte neuronal, ou ser muito suave, o que resultará em um baixo rendimento.

Em seguida, aspire os 2 mililitros superiores do sobrenadante e transfira-o para um novo tubo de 15 mililitros rotulado como "coleção". Repita os procedimentos de coleta mais duas vezes para obter 6 mililitros de sobrenadante. Em seguida, transfira lentamente o conteúdo do tubo de coleta para o tubo gradiente preparado anteriormente, evitando a interrupção do gradiente.

Para purificar os neurônios, centrifugue o tubo gradiente por 15 minutos a 800 x g e 22 graus Celsius. Colete as camadas desejadas e transfira-as em um novo tubo de 15 mililitros. Para obter o isolamento de neurônios de maior pureza, colete a camada 3. Para obter mais rendimento com menos pureza, colete as camadas 2 a 3.

Em seguida, dilua o gradiente de densidade adicionando 5 mililitros de HABG às camadas recém-coletadas. Centrifugue-o a 200 x g por 2 minutos a 22 graus Celsius. Após 2 minutos, rejeitar o sobrenadante e ressuspender as células em 5 mililitros de HABG agitando o sedimento. Em seguida, centrifugue novamente a amostra a 200 x g durante 2 minutos a 22 graus Celsius. Em seguida, descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em 3 mililitros de meio neurobasal sacudindo o pellet.