Descelularização do Complexo Cardiopulmonar: Uma Técnica para Descelularização de Coração e Pulmões a partir de Modelo Murino

A descelularização destitui os órgãos de seus componentes celulares, deixando a estrutura da MEC intacta. Isso ajuda a conservar a arquitetura 3D dos órgãos. Para o procedimento de descelularização, coloque um camundongo sacrificado em decúbito dorsal. Disseque o camundongo e exponha o complexo cardiopulmonar.

Ligue todos os principais vasos originários do coração, exceto a aorta e os principais vasos da circulação pulmonar. Esta etapa evita o vazamento de fluido durante o procedimento de perfusão subsequente. Crie uma abertura na traqueia e insira um cateter por essa abertura. Cateterize a aorta descendente a partir do fundo até que o cateter atinja o arco aórtico.

Suturar os cateteres para garantir sua posição e conectá-los à bomba de perfusão. Comece a perfusão com água deionizada. A perfusão através da aorta permite a remoção eficiente de sangue de toda a vasculatura cardíaca. Eventualmente, a água entra na artéria pulmonar que leva aos pulmões.

Depois de remover completamente o sangue da vasculatura pulmonar, interrompa a perfusão de água e substitua-o por diferentes soluções detergentes que variam de suave a forte. Este procedimento lisa as células liberando os componentes intracelulares, fazendo com que o coração e os pulmões pareçam translúcidos.

Perfunda novamente com água deionizada para remover quaisquer moléculas de detergente restantes. Armazene o complexo cardiopulmonar descelularizado em solução contendo antibióticos, o que garante uma longa vida útil.

Comece raspando o tórax, o abdômen e as costas do camundongo sacrificado com a máquina de cortar cabelo. Desinfete a área com etanol 70%. Em seguida, prenda o mouse em uma bandeja de poliestireno, estendendo seus membros anteriores e posteriores, bem como sua cabeça e cauda. Coloque-o sob o microscópio de microcirurgia.

Usando uma tesoura de padrão reto Mayo, faça uma incisão cutânea que vai da região submandibular até a parte inferior do abdômen e disseque por via subcutânea para expor a parede torácica e o peritônio. Em seguida, use uma tesoura microcirúrgica para cortar os músculos peitoral maior e peitoral menor ao longo do sexto espaço intercostal em ambos os lados da parede torácica.

Corte o esterno ao longo das incisões anteriores com uma tesoura de padrão reto. Em seguida, complete uma esternotomia cortando o esterno ao longo de seu eixo longo. Eleve e fixe ambos os lados da parede torácica para expor o complexo cardiopulmonar. Use micropinças de ponta redonda para extirpar o timo e o tecido adiposo circundante, puxando-os delicadamente de seus anexos e cortando o esôfago com uma microtesoura.

Separe as veias braquiocefálicas e a artéria braquiocefálica com micropinças afiadas. Em seguida, separe as artérias carótida comum esquerda e subclávia esquerda do tecido subjacente para facilitar a ligadura e a cauterização. Use um porta-microagulha e micropinças afiadas e uma sutura 9-0 para colocar os pontos acima da emergência das artérias braquiocefálicas da carótida comum esquerda e da subclávia esquerda. Cauterize as veias braquiocefálicas.

Usando uma microtesoura, abra uma entrada seccionando o ligamento. Introduza um cateter de calibre 27 na traqueia e empurre delicadamente até que a traqueia se ramifique nos brônquios, tomando cuidado para não romper os brônquios. Usando uma sutura 6-0, coloque três pontos ao redor da traqueia para prender o cateter.

Corte o camundongo na altura da 12ª vértebra torácica. A aorta descendente corre anteriormente à coluna vertebral e deve ser seccionada aqui junto com a coluna. Cateterizar a aorta de forma retrógrada e empurrar o cateter até atingir o arco aórtico. Usando uma sutura, coloque quatro pontos ao redor da aorta, começando 5 milímetros abaixo da ponta do cateter.

Conecte o mouse a um sistema de bomba usando tubos de silicone e conectores inferiores. Perfundir com água deionizada a 200 microlitros por minuto por 15 minutos. Em seguida, troque o agente de perfusão para 0,5% de DOC diluído em água deionizada e perfunda durante a noite. No dia seguinte, troque o agente de perfusão para SDS a 0,1% diluído em água deionizada e perfunda por 8 horas. Em seguida, perfunda com água deionizada por 24 horas para lavar o SDS e o DOC.

Ressecção o coração e os pulmões descelularizados seccionando suas ligações ao tórax. Armazene o tecido em um criotubo estéril em água deionizada com penicilina-estreptomicina a 1% e azida sódica 0,3 micromolar a 4 graus Celsius.