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Biologia
0 vistas • 3:38 min • July 8th, 2025
A superfície dorsal da língua do camundongo é coberta por três tipos principais de saliências elevadas chamadas papilas, ou seja, papilas fungiformes, circunvaladas e filiformes. As papilas circunvaladas, ou CVP, compreendendo trincheiras epiteliais que abrigam as papilas gustativas, são sustentadas por uma camada de tecido conjuntivo - a lâmina própria.
Para isolar o epitélio da PVC, comece com um camundongo sacrificado em decúbito dorsal. Em seguida, faça uma incisão nas bochechas e disseque a faixa espessa de tecido - o frênulo lingual - para separar a língua do assoalho da cavidade oral. Transfira a língua excisada para um prato contendo tampão resfriado.
Em seguida, corte a parte anterior da língua. Injete cuidadosamente um coquetel de digestão contendo enzimas dispase e colagenase no espaço subepitelial da região CVP, entre o epitélio e os tecidos subjacentes. Retraia a agulha enquanto injeta a suspensão na região.
Incube a língua pelo tempo apropriado. As dispases e colagenases digerem as proteínas da matriz extracelular dentro do tecido conjuntivo, facilitando a separação do epitélio da PVC do tecido. Após a incubação, faça incisões no epitélio na região do CVP.
Separe suavemente o epitélio solto do tecido subjacente. Finalmente, transfira o epitélio separado da PVC para um tubo revestido de proteína para evitar que o tecido grude na parede do tubo. O epitélio CVP pode ser armazenado para processamento posterior a jusante.
Depois de sacrificar um camundongo adulto, use uma tesoura de dissecação grande e estéril para cortar as bochechas e quebrar a mandíbula. Em seguida, levante a língua e corte o frênulo lingual para separar a língua do assoalho da cavidade oral. Corte a língua e colete-a em dPBS estéril e gelado com cálcio e magnésio.
Sob um microscópio de dissecação, remova e descarte a língua anterior cortando logo anterior da eminência intermolar com uma lâmina de barbear. Em seguida, use um lenço delicado para remover qualquer cabelo e excesso de líquido da parte posterior da língua.
Em seguida, encha uma seringa de 1 mililitro com 200 a 300 microlitros de solução enzimática de injeção e insira uma agulha de calibre 30 e 1/2 polegada logo acima da eminência intermolar até o interior das papilas circunvaladas ou PVC. Injete a solução enzimática por baixo e nas bordas laterais do CVP entre o epitélio e os tecidos subjacentes. Retire a seringa lenta e continuamente da língua enquanto a solução está sendo injetada.
Incube a língua em dPBS estéril sem cálcio/magnésio à temperatura ambiente por precisamente 33 minutos. Usando uma tesoura de dissecção extra fina, faça pequenos cortes no epitélio bilateralmente e logo anterior ao PVC. Em seguida, descasque suavemente o epitélio levantando-o com uma pinça fina. Quando o epitélio da trincheira estiver livre do tecido conjuntivo subjacente, coloque-o em um tubo de microcentrífuga de 2 mililitros pré-revestido com FBS.