Injeção de Microbolhas em Embriões de Camundongos Isolados: Uma Técnica para Entregar Agentes de Contraste de Microbolhas na Vasculatura de Embriões Murinos Vivos

Para a entrega de microbolhas, comece com uma suspensão uniforme de microbolhas com casca lipídica direcionadas às células endoteliais, compreendendo um núcleo gasoso em uma seringa conectada ao tubo.

Carregue este conjunto em uma bomba de seringa e conecte uma agulha de vidro ao tubo. Agora, transfira um embrião de camundongo resfriado expressando receptores específicos de células endoteliais para um prato colocado no palco de um estereoscópio.

Exteriorize suavemente o embrião do saco vitelino e da membrana amniótica. Prenda o saco e as bordas da placenta. Enxágue o embrião com um tampão quente para restaurar seu fluxo sanguíneo. Cubra o embrião com gel de ultrassom pré-aquecido para uma transmissão ideal das ondas de ultrassom. Suplemento com tampão para manter suas condições fisiológicas.

Injete cuidadosamente a suspensão de microbolhas na taxa de fluxo desejada em uma veia adequada na superfície da membrana fetal do disco placentário usando a bomba de seringa. As microbolhas injetadas viajam pela circulação e se ligam aos receptores específicos nas células endoteliais que revestem os vasos sanguíneos.

Use um transdutor de ultrassom para transmitir ondas de ultrassom de alta frequência para o embrião. Os núcleos de gás altamente compressíveis das microbolhas fazem com que elas oscilem de forma não linear, espalhando ondas de ultrassom com frequências diferentes das ondas incidentes. Esses sinais e os sinais lineares do tecido retornam ao transdutor.

O transdutor os retransmite para um sistema de imagem que diferencia os sinais dispersos por microbolhas dos sinais teciduais, produzindo imagens de ultrassom com contraste dos vasos sanguíneos embrionários.

Pipetar o volume necessário de solução-mãe de microbolhas e adicionar à alíquota de soro fisiológico. Misture mexendo delicadamente com a ponta da pipeta. Em seguida, use uma agulha de calibre 21 para aspirar a solução diluída de microbolhas em uma seringa limpa. Depois de remover a agulha, elimine quaisquer bolhas de ar da seringa e conecte o luer e o tubo. Empurre lentamente a solução até o final do tubo, certificando-se de não gerar bolhas de ar.

Por fim, insira a seringa em uma bomba de infusão de seringa ajustada para dispensar as microbolhas a uma taxa de 20 microlitros por minuto para um volume total de 20 microlitros. Prenda uma agulha de vidro puxada na extremidade do tubo. Aproxime a bomba do estágio de injeção. Use uma colher perfurada para selecionar e remover aleatoriamente um embrião do prato de mídia refrigerado. Coloque o embrião em uma placa de dissecação localizada no estágio de ultrassom sob o estereoscópio.

Em seguida, localize o lado do embrião que parece menos vascularizado. Aqui está uma área de baixa vascularização, geralmente adjacente à região da cabeça. Em seguida, use uma pinça fina para cortar ou rasgar apenas o suficiente do saco vitelino e das membranas amnióticas para poder remover o embrião de dentro, mas não mais. Em seguida, manobre suavemente o saco ao redor do embrião. Em seguida, posicione o embrião de lado com a placenta e os vasos umbilicais na frente.

Estabilize a placa de dissecação usando pequenos pedaços de plasticina. Usando quatro alfinetes de insetos, prenda o saco vitelino e as bordas da placenta, evitando vasos importantes. Usando uma seringa contendo PBS pré-aquecido a 45 graus Celsius, lave o embrião até que o sangue possa ser visto fluindo para dentro do embrião. A artéria umbilical é identificada pelo sangue pulsátil vermelho brilhante. A veia umbilical e sua rede vascular associada têm sangue mais escuro e geralmente se sobrepõem aos da artéria umbilical no lado placentário.

Neste ponto, posicione o prato de forma que a injeção possa ser feita confortavelmente. Assim que o embrião reviver, cubra-o, mas não a placenta, com gel de ultrassom pré-aquecido. Use uma pinça fina para remover delicadamente quaisquer bolhas de ar ao redor do embrião e complete o prato com PBS pré-aquecido. Durante todo o procedimento, fique de olho no nível de solução nas seringas PBS e gel e adicione seringas de backup ao copo de aquecimento conforme necessário.

Em seguida, monte a agulha de vidro em uma grande bola de plasticina na borda do prato de dissecação e insira a ponta da agulha no PBS. Escolha uma veia na superfície coriônica do disco placentário o mais longe possível do ramo principal. Em seguida, use uma tesoura para aparar a ponta da agulha de acordo com o tamanho do recipiente, cortando a ponta em um pequeno ângulo. Use a ponta da tesoura de mola para remover quaisquer bordas irregulares de vidro.

Agora, usando a bomba de seringa, injete lentamente a solução de microbolhas a 20 microlitros por minuto na agulha de vidro até que todo o ar seja expelido da ponta da agulha e as microbolhas possam fluir livremente para o PBS. Pare a bomba e reinicie-a para um volume de injeção de 20 microlitros. Não permita que o ar entre na agulha de injeção para evitar a injeção de ar no sistema vascular do embrião.

Insira a ponta da agulha de vidro suavemente na veia selecionada na placenta e certifique-se de que ela esteja imóvel. Afaste a cabeça do estereoscópio e posicione o transdutor de ultrassom de forma que o embrião fique situado uniformemente entre os focos a 6 e 10 milímetros. Em seguida, inicie a imagem e inicie a injeção em bolus das microbolhas. Após um minuto, quando a injeção estiver concluída, inicie o cronômetro para a etapa de aquisição de dados.