Isolamento de bactérias comensais conjuntivais à base de swab: uma técnica para isolar bactérias comensais da conjuntiva do modelo murino

A conjuntiva do olho abriga bactérias comensais. Essa microflora indígena protege o olho de infecções, ativando as células imunológicas para atacar quaisquer micróbios nocivos que entrem nos revestimentos dos olhos.

Para isolar bactérias comensais, coloque um camundongo anestesiado em uma posição lateral. Pegue um cotonete estéril embebido em um meio adequado. Insira a ponta do cotonete úmido na região conjuntival medial do olho esquerdo. Pressione o globo ocular e mova o cotonete para frente e para trás ao longo da conjuntiva para coletar uma população comensal diversificada.

Remova o cotonete e mexa-o em um tubo contendo meio de enriquecimento microbiano. Esta etapa libera as bactérias aprisionadas da malha de algodão do cotonete para o meio. Descarte o cotonete e incube o tubo para facilitar o início do crescimento bacteriano.

Dispense algumas gotas do meio enriquecido inoculado com esfregaço ocular em uma placa de ágar sangue no padrão desejado e incuba. A caseína e as peptonas de soja presentes no meio fornecem nitrogênio necessário para a síntese de peptídeos, enquanto o cloreto de sódio mantém o equilíbrio osmótico.

As bactérias comensais possuem enzimas hemolisina que digerem a hemoglobina presente nos meios sanguíneos. Isso produz um padrão característico na placa de ágar, fazendo com que diferentes bactérias proliferem em colônias morfologicamente distintas. Conte o número de colônias para determinar sua abundância relativa na conjuntiva.

Certifique-se de que o mouse esteja devidamente anestesiado apertando uma almofada da pata traseira. Prossiga apenas se não houver movimento. Designe uma mão para manusear camundongos anestesiados e a outra mão para manusear o cotonete e a cultura. Remova o mouse da gaiola e coloque-o em cima da superfície de trabalho posicionada de lado com o olho esquerdo exposto. Pulverize as mãos enluvadas com isopropanol e seque-as com uma toalha de papel.

Destampe um tubo de microcentrífuga BHI rotulado com a mão dedicada ao manuseio de mídia e coloque o tubo de volta no rack. Mergulhe a ponta revestida de algodão do cotonete no BHI. Em seguida, retire o cotonete do tubo enquanto gira a ponta duas vezes contra o tubo interno para remover o excesso de líquido e removê-lo.

Com a mão de manuseio do mouse, segure suavemente o mouse pela nuca. Com a outra mão, coloque a ponta do cotonete contra a região conjuntival medial do olho esquerdo. Pressione levemente o globo ocular e mova o cotonete em um movimento de lavagem de janela entre a pálpebra inferior e o olho 10 vezes, mantendo a pressão constante. Sem tocar no pelo, remova suavemente a ponta do cotonete perpendicular ao local onde foi inserido. Coloque o cotonete com o lado do algodão voltado para baixo diretamente em um tubo de microcentrífuga rotulado com meio BHI.

Aplique um colírio no olho cotonete. Se desejar, adquira cotonetes de pele ou pele para amostras de controle, esterilizando luvas adequadamente entre cada cotonete. Quando terminar, retorne o mouse para a gaiola. Deixe o cotonete repousar por 10 a 15 minutos no gelo. Em seguida, esterilize as mãos enluvadas e remova o cotonete enquanto mistura a ponta no meio por 10 rotações. Retire o cotonete girando a ponta contra a parede interna do tubo por cinco rotações e descarte-o em um recipiente de risco biológico. Repita o processo para cada mouse.

Enriqueça a amostra incubando os tubos estaticamente por 1 hora a 37 graus Celsius. Durante a incubação, rotule uma placa TSA à temperatura ambiente por zaragatoa de olho de rato ou zaragatoa de controlo e divida-a ao meio. Retire as amostras enriquecidas da incubadora e coloque-as no gelo. Vortex brevemente as amostras para misturar. Em seguida, alíquota de 10 microlitros da amostra na placa TSA e incline a placa para formar uma tira. Repita isso duas vezes.

Do outro lado da linha divisória da placa, crie 10 pontos com 10 microlitros de amostra cada. Incube as placas a 37 graus Celsius por 18 horas, 2 dias e 4 dias em uma câmara limpa que evite que as placas de ágar sequem. Conte as colônias nas tiras. Observe a morfologia e calcule as unidades formadoras de colônias por swab para isolados morfologicamente semelhantes.