Isolamento de células intersticiais da válvula de camundongo: um método enzimático para isolar e cultivar VICs da válvula aórtica de camundongo

A válvula aórtica do coração é uma estrutura de três folhetos composta pelas células intersticiais da válvula interna ou VICs distribuídas por toda a matriz extracelular densa e as células endoteliais da válvula sobrejacente ou VECs.

Para isolar VICs, primeiro, prepare um camundongo sacrificado em decúbito dorsal. Através da linha média abdominal e da incisão torácica, exponha o coração. Faça um pequeno corte entre o átrio esquerdo e o ventrículo, seguido de perfusão salina para drenar o sangue. Corte a aorta ascendente no nível do arco aórtico e colha o coração.

Faça o transecto e descarte os dois terços distais dos ventrículos antes de dissecar longitudinalmente a porção restante do coração para revelar os folhetos da válvula aórtica em forma de "U". Extirpar os folhetos e enxaguar com tampão refrigerado para remover o sangue.

Em seguida, trate os folhetos com solução de colagenase de baixa concentração e incube. Em baixas concentrações, a colagenase - uma enzima proteolítica - quebra apenas parcialmente a matriz extracelular, desalojando os VECs de superfície dos folhetos.

Centrifugue e substitua o sobrenadante contendo enzimas por tampão, transferindo o pellet ressuspenso para uma placa de Petri. Colete os folhetos e trate-os com solução de colagenase altamente concentrada para uma segunda digestão. Após a incubação, a colagenase degrada ainda mais a matriz extracelular, liberando VICs em solução.

Centrifugue para granular os VICs e ressuspenda em meios adequados. Finalmente, semeie um baixo volume da suspensão celular em uma placa de vários poços para facilitar a aderência dos VICs ao fundo do poço. Incubar para permitir que os VICs proliferem.

Antes de iniciar o experimento, limpe e esterilize todos os instrumentos cirúrgicos e espaço de trabalho com etanol 70% e autoclave os instrumentos cirúrgicos por 30 minutos. Quando a configuração inicial estiver pronta, comece limpando o tórax e a região do abdômen de um camundongo sacrificado de 8 semanas usando etanol.

Usando uma tesoura, abra o abdômen e o peito do mouse. Em seguida, corte entre o átrio esquerdo e o ventrículo esquerdo com uma pequena tesoura cirúrgica. Remova o sangue do coração perfundindo 10 mililitros de PBS frio e corte o coração mantendo 3 milímetros da aorta ascendente. Sob um estereomicroscópio, disseque a válvula aórtica cortando o coração horizontalmente no meio dos ventrículos e cortando o ventrículo esquerdo em direção à aorta. Em seguida, disseque cuidadosamente a válvula aórtica. Junte as válvulas em uma pequena placa de cultura de tecidos de 35 milímetros.

Lave as válvulas isoladas em uma placa de cultura de células de 75 mililitros com 5 mililitros de HEPES frio de 10 milimolares recém-preparados, suplementado com antibióticos, e incube em 5 mililitros de colagenase tipo I por 30 minutos a 37 graus Celsius com agitação contínua. Após a incubação, centrifugue o tubo por 5 minutos a 150 x g e lave o pellet uma vez com 2 mililitros de HEPES milimolar com vórtice em alta velocidade por 30 segundos.

Colete a suspensão resultante do tubo em uma placa de cultura de 35 milímetros e use uma pinça fina para transferir cuidadosamente os fragmentos de tecido para um tubo novo. Em seguida, incube o pellet em um tubo de 15 mililitros a 5 mililitros de colagenase tipo I a 37 graus Celsius sob agitação contínua por 35 minutos. Separe as células ressuspendendo com uma pipeta de 1 mililitro e centrifugue a 150 x g por 5 minutos a 4 graus Celsius. Limpe as células duas vezes ressuspendendo o pellet separado em 2 mililitros de DMEM completo e centrifugando a 150 x g por 5 minutos a 4 graus Celsius.

Para o revestimento, ressuspenda o pellet em 1 mililitro de meio completo e adicione-o a um poço de uma placa de cultura de células de 6 poços em uma quantidade mínima de meio. Mantenha as placas intactas a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Após 3 dias de incubação, confirme o crescimento mais próximo dos detritos teciduais observando as células ao microscópio. Quando 1.000 células estiverem visíveis, remova cuidadosamente os detritos do tecido com uma pinça autoclavada e troque o meio.