Por que a imagem longitudinal é importante para a validação de alvos em doenças metabólicas?

A imagem longitudinal permite a observação repetida da dinâmica celular no mesmo animal ao longo do tempo, permitindo aos pesquisadores avaliar a durabilidade e a consistência dos efeitos mediados pelo alvo na função das células beta e na arquitetura das ilhotas, o que apoia decisões mais confiáveis de avançar ou não avançar em programas de validação de alvos.

Como o isolamento das ilhotas pancreáticas do movimento intestinal melhora a qualidade dos dados?

A janela de imagem apoiada por placa metálica separa espacialmente o pâncreas do intestino, reduzindo artefatos de movimento provocados pela peristalse e permitindo imagens estáveis e de alta resolução das estruturas celulares, o que é essencial para medições quantitativas confiáveis no desenvolvimento de ensaios.

Quais medidas quantitativas permitem a avaliação da função das células beta neste modelo?

O método permite a medição da migração de células beta, do fluxo intracelular de cálcio, do tamanho das ilhotas e da perfusão vascular por meio de imagens com lapso de tempo e pilhas z, fornecendo leituras funcionais que associam intervenções genéticas ou farmacológicas a desfechos fenotípicos em um sistema relevante para a doença.

Por que os requisitos de replicação são importantes para a colaboração multifuncional em ensaios baseados em imagem?

A replicação garante que os resultados de imagem sejam consistentes entre animais, operadores e execuções experimentais, o que é essencial para gerar confiança nos resultados do ensaio e permitir comparações confiáveis dos efeitos de compostos entre equipes de descoberta, translacionais e pré-clínicas.

Quais capacidades de análise estatística são necessárias antes de implementar a imagem intravital em um fluxo de descoberta?

A implementação exige capacidade de análise quantitativa de imagens, incluindo rastreamento da intensidade de fluorescência, segmentação de objetos e estatísticas de séries temporais, para comparar condições e avaliar a significância das alterações observadas na dinâmica ou na estrutura celular.

Imagem intravital: um método para observação em nível celular do pâncreas de camundongo através de uma janela de imagem estabilizada

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biologia

0 vistas • 3:40 min • July 8th, 2025

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A imagem intravital envolve a visualização de células de um animal vivo através de uma janela de imagem implantada no animal. Ele permite a observação a longo prazo da dinâmica celular sem comprometer suas funções.

Para começar, pegue um camundongo transgênico anestesiado previamente implantado com uma janela de imagem pancreática apoiada em uma placa de metal. A placa de base separa espacialmente o pâncreas do intestino, reduzindo assim os artefatos de movimento de movimentos fisiológicos, como o peristaltismo.

O camundongo transgênico expressa proteína fluorescente verde ou GFP sob o promotor do gene da insulina expresso em células beta de ilhotas no pâncreas.

Em seguida, segure a cauda do rato com firmeza e borrife desinfetante para remover quaisquer contaminantes da superfície. Insira um cateter na veia lateral da cauda. Injete uma solução contendo anticorpos marcados com uma sonda fluorescente vermelha na veia da cauda. Esses anticorpos se ligam às células que revestem os vasos sanguíneos, manchando-os de vermelho.

Agora, mude o mouse para uma configuração de microscopia intravital. Insira a janela de imagem pancreática no suporte da janela. Inicie a aquisição de imagens sob baixa ampliação para localizar aglomerados de ilhotas fluorescentes verdes cercados por vasos sanguíneos fluorescentes vermelhos. Aumente a ampliação para obter imagens de nível celular de alta qualidade de células beta individuais.

Comece ligando o microscópio intravital, incluindo a potência do laser. Para inserir um cateter vascular, aplique pressão no lado proximal da cauda com o indicador e o terceiro dedo. Se necessário, aqueça a cauda com uma lâmpada. Desinfete a veia da cauda com um spray de etanol a 70% e, em seguida, insira um cateter de calibre 30 na veia da cauda lateral e visualize a regurgitação de sangue no tubo PE-10. Aplique fita adesiva no cateter para estabilizá-lo.

Injete FITC dextrano e TMR dextrano, ou outras sondas fluorescentes, conforme apropriado, de acordo com a combinação de sondas fluorescentes. Insira uma sonda retal para controlar automaticamente a temperatura corporal com o sistema de almofada de aquecimento homeotérmico. Em seguida, insira a janela de imagem pancreática preparada durante a configuração da microscopia intravital no suporte da janela. Transfira o mouse da plataforma cirúrgica para o estágio de imagem.

Para realizar imagens intravitais, comece com imagens do pâncreas em uma ampliação baixa, como quatro vezes, para escanear toda a visão do pâncreas na janela de imagem pancreática. Depois que a região de interesse for determinada, mude para uma lente objetiva de maior ampliação, como 20 ou 40 vezes, para realizar imagens em nível celular com resolução lateral e axial de aproximadamente 0,5 micrômetros e 3 micrômetros, respectivamente.

Execute imagens de pilha z ou lapso de tempo para observar a estrutura 3D ou a dinâmica do nível celular, como a migração celular.