0 visualizações • 4:44 min. • July 8th, 2025
Comece colocando um mouse anestesiado na posição supina. Disseque a cavidade torácica para visualizar o coração. Use um pipetador equipado com uma ponta de furo largo para aplicar pressão de sucção e aspirar o coração do corpo do rato para a ponta. Extirpar o coração na aorta para colhê-lo do corpo do camundongo.
Mergulhe o coração isolado em um béquer contendo um tampão rico em nutrientes suplementado com um agente anticoagulante. O anticoagulante no tampão forma um complexo com o cálcio presente nos cardiomiócitos - as células do músculo cardíaco, cessando a contração dos músculos cardíacos e impedindo a coagulação do sangue.
Em seguida, coloque o ápice do coração voltado para baixo em um suporte de coração mantido em uma placa de Petri contendo tampão adequado. Clampeie a aorta acima dos átrios e transfira o coração clampeado para uma placa de perfusão.
Em seguida, pegue um conjunto seringa-agulha contendo um tampão de perfusão apropriado. Insira a agulha no ventrículo esquerdo perfurando a câmara ventricular.
Com a aorta pinçada, a injeção intraventricular pressuriza as válvulas aórticas para abrir. Consequentemente, o tampão libera o sangue antegradamente através das artérias coronárias, perfundindo completamente os músculos cardíacos. Finalmente, o tampão se espalha pelas veias pulmonares. Isso fornece um coração perfundido com sucesso para aplicações a jusante.
Para a colheita do coração de camundongo, após confirmar a eutanásia e raspar o abdômen, abra a cavidade torácica rapidamente para expor o coração e use uma pipeta de transferência de plástico com a ponta cortada aproximadamente do tamanho do coração, para sugar o coração para dentro da pipeta. Levante a pipeta para criar espaço suficiente para inserir uma tesoura curva e use a tesoura para extirpar o coração do lado dorsal, tomando cuidado para não danificar os átrios.
Imediatamente, coloque o coração em um copo de vidro de 30 mililitros contendo CIB EGTA gelado por cerca de 1 minuto. Quando as contrações pararem, coloque o coração em uma placa de cultura de 35 mililitros contendo CIB EGTA gelado e remova o pulmão e outros tecidos visíveis.
Coloque o coração limpo grosseiramente em um suporte de coração cheio de CIB EGTA resfriado, com o ápice voltado para baixo, e coloque o suporte sob um microscópio estereoscópico. Remova a gordura e os tecidos conjuntivos ao redor da aorta. Se o comprimento da aorta cortada for muito longo, apare a aorta logo abaixo da artéria braquiocefálica e oriente o coração de forma que a superfície anterior fique voltada para a frente. Use uma pinça para levantar a extremidade da aorta e use uma pequena pinça vascular para prender a aorta perto dos átrios, enquanto empurra suavemente os átrios para baixo.
Em seguida, coloque o coração pinçado em uma placa de perfusão, com o lado anterior voltado para cima, e hidrate o coração com algumas gotas de CIB EGTA. Para perfusão anterógrada, coloque uma seringa de 20 mililitros contendo CIB EGTA pré-aquecido conectado a um tubo de extensão flexível e uma agulha de injeção marcada, na bomba de infusão e ligue a bomba a uma taxa de fluxo de 0,5 mililitro por minuto. Quando a agulha e a bomba estiverem cheias, coloque a agulha de injeção na placa de perfusão, com o lado mais curto da forma diagonal à frente, e deslize a agulha até que ela toque o ápice do coração.
Com cuidado, insira a agulha perto do ápice do ventrículo esquerdo, na câmara ventricular sem torcer ou desprender a agulha da placa, observando a marca para estimar a profundidade da inserção da agulha. Quando a inserção da agulha estiver completa, o sangue deve começar a fluir da artéria coronária.
Use fita adesiva para fixar a agulha de injeção na placa e aumente a velocidade da bomba para 1 mililitro por minuto. Se o coração for perfundido com sucesso, o fluxo do tampão no capilar deve ser visível logo abaixo do epicárdio.