Isolando células IPE e RPE: uma técnica para obter células epiteliais pigmentares oculares do olho de coelho

As células epiteliais pigmentares são células cuboidais terminalmente diferenciadas conectadas por junções apertadas. Essas células epiteliais que revestem a íris são as células epiteliais pigmentares da íris ou IPE, e aquelas próximas à retina são as células epiteliais pigmentares da retina ou RPE.

Para extrair essas células, pegue um olho de coelho intacto. Trate o olho com um desinfetante para remover quaisquer microorganismos da superfície do olho. Lave o desinfetante com uma solução tampão. Faça uma incisão perto da íris. Usando essa abertura, faça um corte circular completo ao longo do limite da íris, dividindo o olho em um segmento anterior contendo íris e uma parte posterior compreendendo retina e humor vítreo.

Pegue o segmento anterior e descarte a lente para acessar a íris. Retire a íris e coloque-a em um prato de cultura. Em seguida, pegue o segmento posterior e descarte o humor vítreo gelatinoso e a retina do bulbo ocular.

Trate a íris e o bulbo ocular com tripsina e incuba. A tripsina degrada a junção apertada e as proteínas da matriz extracelular, iniciando a dissociação das células epiteliais. Rejeitar a tripsina e adicionar um meio de cultura adequado. Raspe suavemente a íris e a superfície do bulbo ocular para liberar as células epiteliais no meio.

Finalmente, semeie as células IPE e RPE em poços separados. As células estão prontas para outros ensaios a jusante.

Depois de sacrificar o animal, use uma tesoura curva e uma pinça Colibri para enuclear os olhos e, em seguida, limpe o tecido muscular restante e a pele dos olhos. Colete os olhos em um tubo de 50 mililitros cheio de PBS não estéril e transfira o tubo para a capela de fluxo laminar. Desinfete-os submergindo em solução à base de iodo por dois minutos e, em seguida, transfira os olhos para um tubo de 50 mililitros cheio de PBS estéril.

Coloque um olho em uma compressa de gaze estéril e segure firmemente o olho próximo ao nervo óptico e, em seguida, corte perto do limite da íris com um bisturi # 11. Usando uma tesoura, corte ao redor da íris, remova o segmento anterior e coloque-o em uma placa de Petri deixando o bulbo com o vítreo, até que o epitelial pigmentar da retina, ou células RPE, sejam isolados.

Para isolar o epitelial pigmentar da íris, ou células IPE, remova a lente com uma pinça fina e puxe delicadamente a íris contendo as células IPE. Coloque a íris em uma placa de Petri e lave-a com PBS estéril. Adicione 500 microlitros de tripsina a 0,25% e incube por 10 minutos a 37 graus Celsius. Remova a tripsina, adicione 500 microlitros de meio completo e raspe o IPE delicadamente com uma pipeta Pasteur plana polida a fogo.

Colete a suspensão celular e coloque-a em um tubo de 1,5 mililitro. Conte as células usando a câmara de Neubauer e semeie 0,2 milhão de células por poço em uma placa de 24 poços com 1 mililitro de meio completo. Coloque a placa em uma incubadora e cultive-a a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.

Para isolar as células do EPR, remova o humor vítreo e a retina do segmento posterior com uma pinça fina. Coloque os bulbos em uma placa de 24 poços e adicione 500 microlitros de tripsina a 0,25% por olho e incube por 10 minutos a 37 graus Celsius. Remova a tripsina, adicione 500 microlitros de meio completo por globo e raspe delicadamente as células RPE com uma pipeta Pasteur curvada polida a fogo.

Colete a suspensão celular e coloque-a em um tubo de 1,5 mililitro. Conte as células usando a câmara de Neubauer e semeie as células conforme descrito anteriormente. Coloque a placa na incubadora.