0 visualizações • 4:35 min. • July 8th, 2025
Os bronquíolos são as vias aéreas tubulares dos pulmões. Durante a infecção crônica, os bronquíolos ficam entupidos devido ao acúmulo de muco. O muco rico em nutrientes fornece um ambiente adequado para o crescimento de bactérias oportunistas. Essas bactérias são incorporadas em uma matriz polimérica extracelular autoproduzida e proliferam para formar um biofilme.
Para imitar o desenvolvimento de biofilme bacteriano nos pulmões, pegue uma amostra de tecido bronquiolar de porco em uma placa de Petri. Disseque o tecido em pedaços da forma desejada. Adicione um meio de cultura de biofilme à placa de Petri. Esterilize o prato sob luz ultravioleta para remover quaisquer contaminantes da superfície.
Transfira os pedaços de tecido esterilizado para uma placa multipoços contendo meio de cultura de biofilme e almofadas de agarose, que servem como um substrato ideal para a adesão bacteriana. Em seguida, pique uma ponta de agulha contendo uma colônia das bactérias desejadas em cada pedaço de tecido para introduzir bactérias planctônicas no tecido. Sele a placa com uma membrana porosa esterilizada por UV que facilita a troca uniforme de oxigênio em toda a superfície da placa. Incube a placa selada.
Durante a incubação, as bactérias aderem irreversivelmente à superfície epitelial através do pili e começam a secretar a matriz extracelular. Dentro da matriz, as bactérias utilizam as fontes de energia, mucina e DNA livre dos meios de cultura para formar biofilmes. O modelo de biofilme bacteriano está pronto para testes adicionais.
Coloque o bronquíolo na primeira lavagem DMEM/RPMI 1640. Deixe-o na lavagem e colha seções adicionais de bronquíolo do mesmo pulmão para produzir seções de tecido suficientes para o experimento planejado. Coloque quaisquer seções bronquiolares adicionais do mesmo pulmão na lavagem e deixe-as na lavagem por pelo menos dois minutos.
Remova os bronquíolos da primeira lavagem e coloque as amostras em uma placa de Petri estéril. Segure levemente cada bronquíolo com uma pinça estéril, tomando cuidado para não danificar o tecido. Remova o máximo possível de tecido mole restante e corte o tecido em tiras de cinco milímetros de largura usando uma tesoura de dissecção estéril.
Coloque todas as tiras de tecido bronquiolar na segunda lavagem DMEM/RPMI 1640. Deixe-os na lavagem por pelo menos dois minutos. Em seguida, remova as tiras de tecido da segunda lavagem usando uma pinça estéril e coloque-as em uma placa de Petri limpa e estéril. Remova qualquer tecido mole restante preso ao bronquíolo e corte as tiras em quadrados usando uma tesoura de dissecção estéril.
Adicione a terceira lavagem DMEM/RPMI 1640 na placa de Petri e misture levemente os pedaços de tecido na lavagem girando a placa. Despeje a terceira lavagem da placa de Petri sem remover os pedaços de tecido.
Em seguida, adicione a lavagem final do SCFM, garantindo que todos os pedaços de tecido estejam cobertos. Esterilize o tecido em SCFM sob luz ultravioleta por cinco minutos. Use uma pinça estéril para transferir cada pedaço de tecido bronquiolar esterilizado para poços individuais de uma placa de 24 poços contendo almofadas de agarose SCFM.
Para infectar cada pedaço de tecido com a cepa bacteriana desejada, toque em uma colônia cultivada em uma placa de ágar com a ponta de uma agulha de calibre 29 presa a uma seringa estéril de insulina de 0,5 mililitro. Em seguida, toque a colônia no pedaço de tecido, picando suavemente a superfície. Para os controles não infectados, pique suavemente a superfície do pedaço de tecido com a ponta da agulha.
Em seguida, use uma pipeta para adicionar 500 microlitros de SCFM a cada poço. Esterilize uma membrana de vedação respirável para cada placa de 24 poços sob luz ultravioleta por 10 minutos. Remova a tampa da placa de 24 poços e substitua-a pela membrana respirável. Em seguida, incube as placas a 37 graus Celsius sem agitar.