Edição do genoma baseada em nuclease de dedo de zinco: uma técnica para modificar o genoma em células-tronco pluripotentes humanas por mecanismo de reparo dependente de homologia de fita dupla

A nuclease de dedo de zinco ou ZFN contém um macrodomínio de ligação ao DNA estabilizado por íons de zinco conectado a um domínio de endonuclease por meio de um ligante. Essa estrutura ajuda a manter a especificidade durante o corte do DNA.

Para usar ZFNs para edição de genoma, faça uma cultura de células-tronco pluripotentes humanas. Complemente-o com um plasmídeo que codifica ZFN. Adicione um plasmídeo de reparo contendo o gene alvo e o gene de resistência a antibióticos imprensado entre braços de homologia ou HAs. Eletroporar a mistura célula-DNA onde a corrente elétrica facilita a entrada de plasmídeos dentro da célula.

Uma vez dentro, os motivos de dedo de zinco do ZFN traduzido se ligam aos trigêmeos de pares de bases complementares no genoma do hospedeiro, posicionando corretamente a endonuclease de restrição Fok-1 no local alvo. Os ZFNs se ligam a fitas opostas em pares, permitindo que a homodimerização do Fok-1 forme um centro catalítico ativo no qual o Fok-1 gera quebras de fita dupla de DNA ou DSBs, produzindo uma saliência de quatro nucleotídeos.

A presença de HAs no plasmídeo de reparo orienta o reparo dependente de homologia, onde a extremidade saliente se inverte e usa a sequência homóloga de HA como modelo. A síntese de DNA continua adicionando nucleotídeos complementares ao gene alvo.

As lacunas resultantes são ligadas, facilitando a inserção do gene. Além disso, o gene de resistência a antibióticos sem promotor é expresso a partir de um promotor hospedeiro a montante do local de inserção. As células editadas com sucesso crescem no meio de seleção de antibióticos.

Comece cultivando células-tronco pluripotentes humanas em meio hESC em uma placa de 6 poços contendo células alimentadoras de fibroblastos embrionários de camundongo inativados por mitomicina C, ou MEF, cultivadas em gelatina. A cada dia subsequente após o remeamento, até que o hPSC atinja 50% de confluência, use uma pipeta de vidro e aspire para remover todo o volume do meio. Substitua por 3 mililitros de meio hESC quente por poço.

Um dia antes do direcionamento, remova o meio hESC e adicione um novo meio hESC pré-aquecido suplementado com 10 micromolares Y27632. Além disso, prepare de um a dois 6 No dia da segmentação, prepare as soluções de transfecção pipetando 5 microgramas de plasmídeo de expressão de nuclease dedo de zinco 1 e 2 em um tubo de 1,5 mililitro.

Adicione 30 microgramas do plasmídeo doador de reparo, seguido por solução salina tamponada com fosfato 1X suficiente para trazer o volume para 300 microlitros. Inspecione as células ao microscópio para garantir 50% de confluência. Em seguida, use uma pipeta de vidro e aspire para remover o meio da placa de hPSCs. Em seguida, lave as células com 2 mililitros de PBS 1X quente. Depois de aspirar o PBS, adicione 0,5 mililitros de solução de tripsina EDTA a 0,25%, diretamente nas células.

Coloque na incubadora de cultura de tecidos por aproximadamente 10 minutos ou até que a camada de alimentação comece a se soltar da placa. Após a incubação, adicione 2 mililitros de meio esWash quente a cada poço para interromper a reação de tripsina. Colete as células de cada poço, garantindo que as células alimentadoras saiam como uma folha. Pipete o conteúdo de cada alvéolo em um único tubo cônico de 50 mililitros, combinando todos os poços, e triture as células usando uma pipeta sorológica de 10 mililitros.

Adicione o meio esWash para levar a suspensão da célula a 40 mililitros. Aguarde de um a dois minutos para permitir que grandes pedaços de alimentação se depositem no fundo do tubo, em seguida, remova o sobrenadante usando uma pipeta sorológica e deposite em um novo tubo cônico de 50 mililitros. Depois de centrifugar a suspensão celular durante cinco minutos a 190 x g, aspirar o sobrenadante sem perturbar o sedimento celular. Ressuspenda as células em 500 microlitros de PBS 1X.

Combine as células ressuspensas com a solução de transfecção de plasma preparada anteriormente. Pipete as células e a mistura de transfecção em uma cubeta de eletroporação de 4 milímetros e coloque no gelo por três a cinco minutos. Defina os parâmetros para o programa exponencial no sistema de eletroporação para 250 volts, 500 microFarads, resistência infinita e tamanho da cubeta de 4 milímetros. Eletropore as células e, em seguida, coloque a cubeta de volta no gelo por três minutos.

Ressuspenda as células eletroporadas em 18 mililitros de meio hESC quente suplementado com 10 micromolares Y27632. Inspecione os MEFs DR4 ao microscópio. Coloque 3 mililitros da suspensão de célula única em cada poço de uma placa de 6 poços contendo células alimentadoras DR4 e retorne à incubadora. No terceiro dia após o plaqueamento, substitua o meio nas células por meio hESC sem Y27632. No dia 4, substitua o meio não suplementado por um meio contendo o antibiótico de seleção apropriado. Puromicina é usada aqui.