Edição do genoma baseada em nuclease de dedo de zinco: uma técnica para modificar o genoma em células-tronco pluripotentes humanas por mecanismo de reparo dependente de homologia de fita dupla

A nuclease de dedo de zinco ou ZFN contém um macrodomínio de ligação ao DNA estabilizado por íons de zinco conectado a um domínio de endonuclease por meio de um ligante. Essa estrutura ajuda a manter a especificidade durante o corte do DNA.

Para usar ZFNs para edição de genoma, faça uma cultura de células-tronco pluripotentes humanas. Complemente-o com um plasmídeo que codifica ZFN. Adicione um plasmídeo de reparo contendo o gene alvo e o gene de resistência a antibióticos imprensado entre braços de homologia ou HAs. Eletroporar a mistura célula-DNA onde a corrente elétrica facilita a entrada de plasmídeos dentro da célula.

Uma vez dentro, os motivos de dedo de zinco do ZFN traduzido se ligam aos trigêmeos de pares de bases complementares no genoma do hospedeiro, posicionando corretamente a endonuclease de restrição Fok-1 no local alvo. Os ZFNs se ligam a fitas opostas em pares, permitindo que a homodimerização do Fok-1 forme um centro catalítico ativo no qual o Fok-1 gera quebras de fita dupla de DNA ou DSBs, produzindo uma saliência de quatro nucleotídeos.

A presença de HAs no plasmídeo de reparo orienta o reparo dependente de homologia, onde a extremidade saliente se inverte e u