Carregamento de esferas para introduzir ácidos nucléicos em células cultivadas aderentes: uma técnica para carregar plasmídeos codificadores de proteínas fluorescentes em células de mamíferos aderentes

Comece com uma cultura de células de mamíferos aderentes em uma placa de cultura. Transfira esferas de vidro esterilizadas tratadas com álcalis, do tamanho de mícrons, para a câmara de um aparelho carregador de esferas personalizado. Cubra a abertura da câmara usando uma malha com aberturas de tamanho ideal para permitir que os cordões passem durante o carregamento. Prenda a malha com um conjunto de câmara de imagem.

Remova a mídia da placa. Pipete uma suspensão de DNA plasmidial codificador de proteína repórter fluorescente na placa para distribuição uniforme sobre as células. Usando o aparelho carregador de contas, disperse suavemente uma monocamada de contas de vidro nas células. Bata brevemente na placa de cultura com força adequada.

As contas de vidro rolam brevemente sobre as células aderentes, enquanto o tratamento alcalino as torna menos aderentes às células. O impacto das colisões entre grânulos e células transmite tensão adequada, criando rupturas localizadas nas membranas celulares. Esses poros transitórios formados de pequenas dimensões facilitam a absorção do DNA do plasmídeo nas células, evitando a entrada de grandes grânulos.

Durante o período de recuperação, a membrana celular se fecha novamente, restaurando a integridade da membrana e aprisionando o DNA do plasmídeo. Adicione mídia à placa e aspire cuidadosamente quaisquer contas flutuantes visíveis da placa. Incube a placa.

Células transfectadas com sucesso contendo DNA de plasmídeo expressam as proteínas repórter fluorescentes, que podem ser visualizadas sob um microscópio de fluorescência.

Remova o meio das células e aspire suavemente todo o meio ao redor das bordas da câmara. Em seguida, incline a câmara em um ângulo de aproximadamente 45 graus e remova a gota restante de mídia no micropoço central. Pipetar suavemente a solução de carregamento de esferas sobre o micropoço de vidro presente no centro da câmara.

Use o aparelho de carregamento de esferas para dispersar suavemente uma monocamada de contas de vidro na parte superior das células. Certifique-se de que as contas cubram completamente as células. Aperte a câmara com dois dedos. Levante-o cerca de cinco centímetros e abaixe-o com firmeza usando uma força aproximadamente equivalente a deixar cair o prato dessa altura.

Adicione suavemente o meio de volta à câmara, pipetando lentamente no lado plástico da câmara. Aspire quaisquer contas flutuantes sem perturbar as células. Todo o procedimento de carregamento do cordão deve ser realizado de forma relativamente rápida, para que as células não sequem quando estiverem sem meio. Em seguida, incube as células por 0,5 a 2 horas na incubadora.