Transformação genética mediada por agrobactérias: um método para transformar geneticamente o genoma do arroz por meio de Agrobacterium tumefaciens geneticamente modificado

Agrobacterium tumefaciens, uma bactéria patogênica de plantas, pode ser geneticamente modificada pela introdução de um plasmídeo Ti preparado artificialmente, carregando um gene de interesse em seu DNA de transferência ou região T-DNA, e um plasmídeo auxiliar carregando os genes de virulência ou Vir para transferir o T-DNA para células vegetais.

Para a transformação genética mediada por Agrobacterium, comece com uma inflorescência de arroz jovem e corte-a em pequenos pedaços. Transfira as estacas para um meio de crescimento e incube para facilitar o crescimento das estacas em uma massa celular indiferenciada chamada calo.

Agora, transfira o calo para um meio de infiltração de Agrobacterium contendo acetosiringona - um quimioatraente para Agrobacterium. Em seguida, adicione uma cultura de Agrobacterium geneticamente modificado ao meio e incube brevemente.

As moléculas de acetosiringona ativam a proteína receptora celular - VirA - na membrana de Agrobacterium, que medeia ainda mais a fosforilação de uma proteína ativadora transcricional - VirG. O VirG fosforilado se move em direção ao plasmídeo auxiliar e ativa a transcrição de uma cascata de genes de virulência, incluindo proteínas de canal e endonucleases - VirD1 e VirD2.

As proteínas do canal formam um canal de transporte conectando a célula bacteriana e vegetal, enquanto as endonucleases se ligam às sequências de borda no plasmídeo Ti e clivam o T-DNA com VirD2, ligado em uma extremidade. A partir daí, o VirD2 direciona a entrada do T-DNA através do canal de transporte para as células do calo e facilita sua integração no genoma do arroz.

Limpe cada inflorescência com um cotonete com álcool 70% e deixe secar antes de cortar. Leve a inflorescência para uma bancada de laboratório estéril e corte-a em pedaços pequenos com uma tesoura esterilizada. Em seguida, transfira as estacas para uma placa de Petri contendo meio NBD2.

Incubar a placa no escuro a 26 graus Celsius, por 10 a 14 dias para induzir calos. Para realizar a transformação, transfira uma única colônia da placa YEB com antibióticos seletivos para 5 mililitros de meio YEB líquido contendo os mesmos antibióticos, em um tubo de ensaio estéril cônico de 50 mililitros. Agite o tubo em um agitador orbital a 250 x g e 25 a 28 graus Celsius até que as bactérias cresçam para um OD₆₀₀ de 0,5.

Adicionar 1 mililitro de suspensão bacteriana a 100 mililitros de meio YEB com os mesmos antibióticos seletivos, em um frasco cônico de 250 mililitros, e agitar o frasco em um agitador orbital a 250 x g e 28 graus Celsius por quatro horas. Centrifugue a cultura a 4.000 x g por 10 minutos em temperatura ambiente, para coletar as bactérias. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento com meio AAM-AS e diluir a suspensão até OD₆₀₀ de 0,4.

Após a incubação, recolher cerca de 150 calos esbriogénicos saudáveis, amarelo-claros, para um balão estéril de 150 mililitros. Adicione 50 a 75 mililitros da suspensão de células bacterianas no frasco e, em seguida, adicione 10 a 25 mililitros de meio AAM-AS fresco, para imergir os calos por 10 a 20 minutos, agitando ocasionalmente.

Despeje a suspensão bacteriana para fora do frasco com cuidado e seque os calos com papel de filtro estéril. Em seguida, coloque-os em uma placa de Petri com meio NBD-AS e cubra-os com papel de filtro. Incube os calos a 25 a 28 graus Celsius no escuro por três dias, verificando se há crescimento excessivo de bactérias.

Após três dias de co-cultivo, transfira os calos para uma placa de Petri estéril usando papel de filtro e, em seguida, seque-os ao ar por duas horas em uma bancada limpa. Certifique-se de que os calos não estejam aderidos ao papel de filtro e transfira-os para o meio de seleção primário NBD2.

Após duas semanas, transfira os calos uniformemente para uma nova placa contendo meio de seleção fresco. Em seguida, mova os calos para o meio MS fresco para diferenciação e os botões dos brotos para o meio MS (com 10 mg / L de higromicina) para proliferar mais brotos.