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Técnicas Biológicas
0 vistas • 2:44 min • July 8th, 2025
A esteatose hepática é uma condição patológica caracterizada por um acúmulo excessivo de gorduras nos hepatócitos - um tipo de célula hepática proeminente. As gorduras se depositam na forma de gotículas lipídicas de tamanhos variados no citoplasma dos hepatócitos.
Estruturalmente, uma gotícula lipídica contém um núcleo de gorduras hidrofóbicas neutras, como triglicerídeos e ésteres de colesterol. O núcleo é circundado por uma monocamada de fosfolipídios decorada com várias proteínas.
Para visualizar a deposição de gordura, pegue uma placa de vários poços contendo uma cultura de hepatócitos aderente. As células são pré-tratadas com um meio esteatogênico para induzir o acúmulo de gotículas lipídicas dentro delas.
Adicione a concentração desejada de paraformaldeído, que se difunde nas células e reticula as proteínas. Esta etapa desativa as proteases e preserva a estrutura dos hepatócitos. Rejeitar o paraformaldeído e adicionar a solução de óleo-vermelho-O que contém o corante orgânico dissolvido em isopropanol.
O isopropanol atua como um solvente transportador para as moléculas de óleo-vermelho-O moderadamente solúveis. Isso ajuda as moléculas do corante a entrar nos hepatócitos fixos e, eventualmente, atingir as gotículas lipídicas. Uma vez dentro, o corante é transferido do isopropanol para lipídios neutros devido à sua maior afinidade, formando o complexo corante-lipídio. Isso resulta na coloração vermelha das gotículas lipídicas.
Descarte o excesso de corante e observe as células ao microscópio. As gotículas lipídicas intracelulares aparecem intensamente vermelhas.
Coloque uma lamínula de cultura de células em cada poço em uma placa de 24 poços e semeie células HepG2, conforme descrito no manuscrito do texto. Após a incubação apropriada, lave as células com 1 mililitro de PBS e descarte o sobrenadante. Fixe-os com 1 mililitro de paraformaldeído a 4% em PBS e incube por 1 hora em temperatura ambiente. Descarte o excesso de paraformaldeído e enxágue as células com 1 mililitro de água destilada.
Em seguida, adicione 1 mililitro de isopropanol a 70% e incube por 5 minutos. Descarte o excesso de isopropanol e adicione 1 mililitro de solução de óleo vermelho O e incube por 30 minutos. Descarte o excesso de solução de óleo vermelho O e, em seguida, enxágue com 1 mililitro de água destilada. Observe as células ao microscópio com uma ampliação de 400x.