Coloração com vermelho do Nilo: uma técnica para detectar e quantificar lipídios neutros intracelulares em algas

As algas são organismos fotossintéticos aquáticos que produzem uma variedade de lipídios, dos quais os lipídios neutros são essenciais para a produção de biodiesel.

Para detectar e quantificar lipídios neutros, misture um volume ideal de suspensão de algas e etanol em uma placa de microtitulação preta. A parede celular e a membrana das algas, que impedem a penetração da maioria das manchas, tornam-se permeáveis quando expostas ao etanol. Em seguida, combine o etanol com um corante fluorescente lipossolúvel - vermelho Nilo. Adicione esta mistura ao poço que contém algas.

Colocar a placa de microtitulação num espectrofotómetro. Defina um programa que garanta a incubação com agitação intermitente para facilitar a interação entre o corante e as algas.

Como o vermelho do Nilo é hidrofóbico, ele não pode atravessar facilmente o citoplasma. Solventes como o etanol, quando acoplados ao vermelho do Nilo, mobilizam o corante e o ajudam a atingir os corpos lipídicos dispersos no citoplasma. O vermelho do Nilo então penetra nos corpos lipídicos e se solubiliza lá, corando os lipídios.

As células deficientes em lipídios aparecem como anéis fluorescentes com corpos escuros, enquanto as células ricas em lipídios mostram um brilho vermelho-alaranjado brilhante onde os corpos lipídicos são acumulados.

Depois de corar as células, exponha-as a um comprimento de onda que excite ao máximo os lipídios neutros. Registar a fluorescência resultante e correlacioná-la com uma curva de calibração para quantificar os lípidos neutros nas amostras de ensaio.

Para a quantificação fluorométrica, preparar todas as amostras de algas com a mesma concentração de biomassa e da mesma forma que os padrões utilizados na medição. Faça isso suspendendo amostras pré-secas na quantidade apropriada de tampão fosfato. Se necessário, use um homogeneizador para facilitar a ressuspensão de células de algas secas.

Para cada amostra, misture 80 microlitros de uma solução preparada de etanol a 30%, 10 microlitros de uma solução preparada de Vermelho do Nilo e 10 microlitros de suspensão de algas, em um único poço de uma placa de 96 poços. Para ter devidamente em conta a variabilidade da medição de fluorescência, efectuar cinco réplicas de cada amostra. Em seguida, execute uma curva de calibração de dois pontos com padrões preparados previamente, a fim de levar em conta as variações do dia-a-dia no instrumento e na preparação.

Para realizar as medições de fluorescência em um espectrofotômetro leitor de placas de vários poços, defina os parâmetros para agitar a 1.200 rpm e orbitar 3 milímetros por 30 segundos, seguido de incubação a 40 graus Celsius por 10 minutos. Outro agitar a 1.200 rpm, e orbitar 3 milímetros por 30 segundos, e registrar fluorescência, com excitação a 530 nanômetros e emissão a 604 nanômetros. Em seguida, inicie a corrida. Como etapa final, converta as medições de fluorescência em teor de óleo usando os resultados dos padrões internos.