Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Técnicas Biológicas
0 visualizações • 3:10 min. • July 8th, 2025
As células musculares lisas vasculares, ou VSMCs, são os componentes celulares proeminentes na túnica média - a camada intermediária da parede do vaso sanguíneo. Em resposta a pistas patológicas ou envelhecimento, essas células medeiam a calcificação vascular - um fenômeno de acúmulo de cálcio na matriz extracelular.
Pegue uma placa de vários poços contendo uma camada aderente de cultura VSMC aórtica murina pré-calcificada. Incube as células com solução de formalina para reticular as proteínas celulares e estabilize a estrutura do VSMC antes da coloração.
Comece a coloração de von Kossa aspirando formalina do poço e adicionando solução de nitrato de prata. Incube a placa sob uma fonte de luz apropriada.
Uma vez que a solução de nitrato de prata atinge os locais de calcificação na matriz extracelular da camada VSMC, os íons de prata substituem os íons de cálcio ligados ao fosfato. Isso resulta em uma coloração amarela transitória. Na presença de matéria orgânica e luz, a degradação fotoquímica do fosfato de prata resulta na formação de prata metálica de cor preta.
Rejeitar a quantidade máxima de solução de nitrato de prata gasta. Trate as células com solução de tiossulfato de sódio. Esta solução converte os sais de prata residuais em um complexo solúvel em água, que pode ser removido por meio de um enxágue final com água, melhorando o contraste da coloração.
Visualize as células coradas para localizar os depósitos pretos insolúveis indicando calcificação.
Para induzir a calcificação nas células musculares lisas vasculares, transfira as células para a placa de cultura de seis poços e permita que elas adiram. Em seguida, realimente as células em meio de calcificação. Incube as células a 37 graus Celsius por pelo menos sete dias. Em seguida, aspire o meio da placa de cultura de células. Lave as células uma vez em água deionizada.
Fixe as células colocando-as em 1 mililitro de formalina a 10% em temperatura ambiente por 20 minutos. Em seguida, remova a formalina e lave as células fixas com água destilada por 5 minutos.
Em seguida, incube as células em 1 mililitro de solução de nitrato de prata a 5% sob uma lâmpada de 60 a 100 watts por 1 a 2 horas. Em seguida, aspire a solução de nitrato de prata e lave com água destilada por 5 minutos. Após 5 minutos, remova a prata que não reagiu colocando as células em 1 mililitro de solução de tiossulfato de sódio a 5% em água destilada por 5 minutos. Em seguida, enxágue as células com água destilada por 5 minutos. As células coradas com von Kossa estão agora prontas para imagens com microscopia de luz invertida padrão.