Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Técnicas Biológicas
0 visualizações • 3:50 min. • July 8th, 2025
Para coloração negativa de vírus envelopados, comece com a suspensão viral desejada. Incube os vírus com glutaraldeído, um fixador químico. Após a penetração, o glutaraldeído reticula as proteínas virais e os ácidos nucléicos, inativando os vírus e preservando a morfologia, facilitando assim o manuseio seguro do vírus. Transfira esta mistura para uma placa de vários poços.
Conecte a microscopia eletrônica de transmissão, TEM, grades contendo cápsula a uma pipeta por meio de um acoplador. Usando a pipeta, aspire a mistura fixadora de vírus para dentro da cápsula. Incube o conjunto da pipeta para que os vírus sejam adsorvidos nas superfícies da grade.
Remova a mistura. Lave a cápsula, removendo vírus não aderentes e fixadores. Pipete uma solução de acetato de uranilo, um corante à base de metais pesados, para dentro da cápsula. Incube para permitir que a mancha entre em contato com os vírus.
Os íons uranila se ligam a glicoproteínas e fosfolipídios específicos da membrana nas superfícies virais. Os íons podem penetrar nos vírus e se ligar às proteínas do nucleocapsídeo que envolvem o genoma. Essa ligação induz a agregação e deposição de íons de metais pesados ao redor do vírus e estruturas virais específicas.
Separe a cápsula. Remova o excesso de mancha das grades e seque ao ar.
Durante a imagem TEM, feixes de elétrons de alta energia atravessam o vírus, fazendo com que as regiões coradas densas em elétrons do vírus espalhem mais elétrons. No entanto, a baixa densidade eletrônica geral do vírus permite que os elétrons atravessem. O sistema de imagem processa esses elétrons espalhados de maneira diferente, produzindo uma imagem de alto contraste.
Os vírus corados negativamente parecem mais claros com o nucleocapsídeo escuro contra uma borda escura, facilitando a visualização da ultraestrutura.
Para começar, misture a suspensão do vírus com um volume igual de 4% de glutaraldeído para obter uma concentração final de 2% de glutaraldeído. Usando fixador, inative o vírus por pelo menos 24 horas. Descontamine o tubo e transfira-o para a instalação BSL2-EM.
Depois disso, conecte uma captura carregada em grade a uma pipeta. Aspire a mistura para a cápsula. Coloque a pipeta de lado com as grades orientadas horizontalmente por 10 minutos.
Em seguida, pegue a pipeta e expulse a mistura de vírus em um recipiente de lixo. Aspire 40 microlitros de água deionizada para dentro da cápsula e, em seguida, descarte a água em um recipiente de lixo. Repita esta lavagem três vezes.
Depois disso, aspire 40 microlitros de 1% de UA ou 1% de PTA na cápsula por 30 segundos. Remova a cápsula da pipeta. Usando papel de filtro, seque as grades e, em seguida, deixe as grades secarem ao ar.