JoVE Encyclopedia of Experiments
Técnicas Biológicas
0 vistas • 3:14 min • July 8th, 2025
Para coloração específica do citoplasma celular em microambientes de tecidos moles, obtenha um rim de camundongo recém-colhido. Trate-o com uma solução fixadora contendo formaldeído, ácido acético glacial e metanol. Incubar a baixas temperaturas.
O formaldeído penetra nas células, reticulando proteínas com proteínas e proteínas com ácidos nucléicos. O metanol desloca a água do tecido e coagula as proteínas. O ácido acético causa acidificação intracelular e inchaço do tecido, neutralizando assim o encolhimento do tecido causado pelo metanol.
A fixação inativa as enzimas e estabiliza a morfologia do tecido para coloração subsequente. Remova o excesso de fixadores usando tampão. Incube o tecido com eosina Y, um corante ácido.
A eosina penetra nas células fixas e entra no citoplasma. O ambiente ácido do citoplasma, proveniente do tratamento com ácido acético, causa protonação máxima de grupos amino de proteínas citoplasmáticas.
A eosina, com grupos funcionais carregados negativamente, interage eletrostaticamente com grupos protonados de proteínas, formando um complexo corante-proteína estável, e cora o citoplasma de rosa após o acúmulo. Após a incubação, corte o rim corado em pequenos pedaços, seguido de desidratação do tecido no aumento das concentrações de etanol.
Incorpore o tecido renal em cera de parafina. Obtenha seções finas de tecido usando um micrótomo. Além disso, reidratar as seções para análise microscópica.
Os núcleos das células não coradas aparecem brancos contra um citoplasma corado de rosa, permitindo a visualização de microestruturas renais, como túbulos contorcidos proximais, compreendendo células epiteliais com bordas em escova, ou ductos coletores, que são revestidos com células epiteliais achatadas sem bordas em escova.
Comece fixando as amostras de tecido mole. Encha um tubo de centrífuga de 50 mililitros com uma solução fixadora contendo 9,5 mililitros de formaldeído a 4% e 0,5 mililitros de ácido acético glacial. Adicione a amostra de tecido mole ao tubo da centrífuga e leve à geladeira por 24 a 72 horas.
Após a refrigeração, lave a amostra de tecido mole com solução de DPBS por 1 hora. Em seguida, core a amostra colocando-a em 2 mililitros de solução de coloração Y de eosina e incube-a em uma placa de agitação horizontal por 24 horas.
No dia seguinte, retire cuidadosamente a amostra de tecido mole do recipiente de amostra e remova o excesso de agente de coloração com papel de seda de celulose. Coloque-o em um recipiente cônico acima de uma fase de vapor de etanol para armazenamento e uso posterior.