Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Técnicas Biológicas
0 visualizações • 4:33 min. • July 8th, 2025
Durante a metástase do câncer, as células tumorais de um tumor primário viajam pelo sistema circulatório, extravasam para órgãos distantes e estabelecem tumores secundários.
Para avaliar a metástase pulmonar em um modelo de camundongo com câncer de mama que foi injetado com células 4T1, células de câncer de mama altamente metastáticas, prepare uma suspensão celular, incluindo células 4T1, isoladas dos pulmões colhidos. Centrifugue a suspensão e ressuspenda as células em meios contendo 6-tioguanina, 6-TG - um análogo da guanina. Semeie a suspensão celular em uma placa de cultura.
O 6TG entra nas células normais, onde a enzima transferase específica o converte em nucleotídeo 6-TG, um nucleotídeo tóxico. Esses nucleotídeos citotóxicos são incorporados ao DNA, causando danos ao DNA e eliminam seletivamente as células da cultura. As células 4T1 têm capacidade reduzida de formar nucleotídeos tóxicos, facilitando sua sobrevivência e aderência à placa. Dependendo da capacidade proliferativa das células, elas formam colônias.
Trate as células com metanol. O metanol permeabiliza as células e desnatura as proteínas celulares. Incubar as células com azul de metileno.
O corante carregado positivamente entra na célula, interage com o DNA carregado negativamente, intercalando-se em espaços entre os pares de bases adjacentes das fitas de DNA. Também se liga ao RNA no citoplasma, mas com menor afinidade. Os núcleos ficam azuis escuros devido à alta concentração de DNA do que o citoplasma devido à baixa concentração de RNA. As colônias metastáticas aparecem como pontos azuis.
Imagem da placa. Use um software para determinar as colônias metastáticas, quantificando a carga metastática nos pulmões do camundongo.
Aumente o volume do tubo para 10 mililitros com 1X HBSS. Em seguida, despeje o conteúdo sobre um filtro de células de 70 micrômetros no tubo cônico de 50 mililitros. Use o êmbolo de uma seringa de 1 mililitro para moer suavemente a amostra através do filtro.
Centrifugue o tubo por 5 minutos a 350 vezes g e descarte o sobrenadante. Em seguida, lave o pellet duas vezes com 10 mililitros de 1X HBSS. Ressuspenda o pellet em 10 mililitros de 60 micromolares de meio de cultura completo de 6-tioguanina e coloque as amostras nas placas de cultura de células de 10 centímetros usando um esquema de diluição, se desejado.
Incube as placas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 5 dias. Despeje o meio de cultura das placas no recipiente de resíduos apropriado. Para fixar as células, adicione 5 mililitros de metanol não diluído a cada placa e incube por 5 minutos em temperatura ambiente, certificando-se de agitar o metanol para cobrir toda a placa.
Despeje o metanol das placas no recipiente de lixo apropriado e, em seguida, enxágue cada placa com 5 mililitros de água destilada. Adicione 5 mililitros de azul de metileno a 0,03% por placa e incube por 5 minutos em temperatura ambiente, certificando-se de agitar a solução de azul de metileno para cobrir toda a placa. Despeje o azul de metileno no recipiente de lixo apropriado e enxágue cada placa novamente com 5 mililitros de água destilada.
Vire o prato de cabeça para baixo e seque-o contra uma toalha de papel para remover o excesso de líquido. Coloque o prato na tampa e deixe secar ao ar durante a noite. As colônias metastáticas serão azuis. Depois que as placas secarem, elas podem ser armazenadas em temperatura ambiente indefinidamente.