Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Técnicas Biológicas
0 visualizações • 2:50 min. • July 8th, 2025
Os nervos periféricos consistem em axônios cercados por células de Schwann que envolvem os axônios com várias camadas de membranas celulares ricas em lipídios, formando a bainha de mielina.
Para visualizar os nervos periféricos, comece com uma lâmina de vidro carregando uma seção de nervo periférico de rato transversal, fixa, embebida em resina e tratada com tetróxido de ósmio. Seções embebidas em resina ajudam a manter a morfologia do tecido.
O tratamento com tetróxido de ósmio causa deposição de ósmio metálico na camada lipídica da bainha de mielina no local do tecido.
Pipetar solução alcalina de azul de toluidina sobre a secção do tecido. Seque a lâmina a uma temperatura adequada. As condições alcalinas e o calor facilitam a penetração do azul de toluidina através da resina na seção do tecido.
O azul de toluidina, sendo um corante catiônico, liga-se aos grupos fosfato carregados negativamente no DNA e também intercala entre os pares de bases do DNA nos núcleos das células de Schwann. Além disso, o corante se liga ao RNA no citoplasma, fora da bainha de mielina.
Adicione uma solução de montagem sobre a seção do nervo corado e cubra com uma lamínula para preparar o tecido para a imagem. Sob um microscópio óptico, as camadas da bainha de mielina aparecem pretas com estruturas de fibras nervosas mielinizadas definidas após o tratamento com ósmio, enquanto os axônios permanecem sem coloração.
Os núcleos das células de Schwann e o citoplasma apresentam diferentes tons de azul devido à propriedade metacromática do corante, facilitando a visualização da morfologia do axônio e do grau de mielinização nos nervos periféricos.
Para manchar as seções nervosas, use uma pipeta de plástico ou micropipetador para adicionar uma gota de solução de azul de toluidina na parte superior das seções nervosas. Após 20 a 30 segundos, enxágue todo o excesso de solução de azul de toluidina, mergulhando suavemente as lâminas em uma jarra de água deionizada, repetindo 3 a 4 vezes até que as seções estejam limpas.
Seque as lâminas por pelo menos 15 minutos a 60 graus Celsius ou durante a noite em temperatura ambiente. Após a secagem, adicione um meio de montagem regular e cubra as seções com uma lamínula. Finalmente, examine as seções montadas sob um microscópio de luz. Uma lente de imersão em óleo de 100X é recomendada para imagens detalhadas para calcular as proporções g.