JoVE Encyclopedia of Experiments
Técnicas Biológicas
0 vistas • 3:32 min • July 8th, 2025
Para visualizar as regiões de cartilagem e osso em uma seção de tecido, comece com uma lâmina de vidro carregando uma fina seção de tecido embrionário de camundongo congelado de interesse.
Descongele brevemente a criossecção e mergulhe-a em uma concentração adequada de etanol para remover o meio de crioincorporação. A etapa de remoção ajuda a evitar o afrouxamento do meio, o que pode afetar a visualização do tecido durante a coloração. Além disso, o etanol fixa o tecido, mantendo a morfologia e integridade do tecido.
Em seguida, pipete uma solução de violeta cresil no tecido. O violeta de cresila, um corante básico carregado positivamente, liga-se a porções polianiônicas, como proteoglicanos, na matriz do tecido cartilaginoso. Considerando que, em tecido mineralizado, como ossos, ele reage com grupos carregados negativamente, como grupos fosfato na matriz óssea.
Por ser um corante metacromático, o violeta de cresil cora diferentes regiões do tecido em cores diferentes do corante natural com base em sua interação com diferentes constituintes químicos dentro dessas regiões.
Agora, lave o tecido em uma concentração adequada de etanol para remover o excesso de mancha. Mergulhe o tecido em concentrações crescentes de etanol para substituir a água do tecido, desidratando o tecido. Lave o tecido com xileno para deslocar o etanol, tornando o tecido transparente para microscopia.
Sob um microscópio óptico, o tecido cartilaginoso parece magenta, enquanto o tecido ósseo parece marrom, facilitando sua diferenciação entre si e do tecido circundante.
Prepare três tubos de centrífuga de 50 mililitros rotulados. Adicione 45 mililitros de etanol a 80% a cada tubo. Coloque três tubos no gelo. Coloque um tubo contendo 45 mililitros de etanol a 95% e um tubo contendo etanol a 100% no gelo. Em seguida, adicione 45 mililitros de xileno a um tubo de centrífuga de 50 mililitros em temperatura ambiente.
Descongele brevemente uma lâmina de membrana PEN colocando-a contra uma mão enluvada e lave-a duas vezes por 30 segundos em cada um dos tubos contendo 80% de etanol com agitação, para remover o composto de temperatura de corte ideal. Em seguida, coloque o slide em uma folha de papel alumínio. Pipete 0,8 mililitros de 0,1% de violeta de cresil em etanol a 50% na lâmina e core por 30 segundos.
Lave a lâmina no terceiro tubo contendo 80% de etanol por 30 segundos. Desidrate a lâmina passando-a pelo tubo contendo etanol a 95% por 30 segundos, o tubo contendo etanol a 100% por 30 segundos e, finalmente, o tubo contendo xileno por 30 segundos. Depois disso, coloque as lâminas em um limpador de tarefas delicadas por 5 minutos para deixar o xileno escorrer e deixar as seções secarem.