Coloração de cristal violeta: uma técnica para visualizar células cancerígenas resistentes a medicamentos usando ensaios de formação de colônias

Em uma população heterogênea de células tumorais, o tratamento com um medicamento anticâncer mataria a maioria das células, mas as células resistentes a medicamentos sobrevivem, resultando em falha terapêutica.

Para determinar a proporção de células resistentes a medicamentos, semeie uma população heterogênea de células tumorais em uma placa de vários poços. Incubar para facilitar a adesão celular. Adicione uma concentração crescente de uma solução adequada para medicamentos anticancerígenos.

A interação com moléculas de drogas faz com que as células sensíveis morram e, posteriormente, se desprendam das placas de cultura. Em contraste, as células resistentes a medicamentos sobrevivem e permanecem presas à placa.

Aspire o meio gasto para remover as células destacadas. Adicione meios frescos sem drogas e incube a placa em condições fisiológicas. As células resistentes a medicamentos proliferam e formam colônias tumorais. Agora, adicione a solução de coloração violeta de cristal às colônias e incuba.

O cristal violeta, uma coloração de cor roxa, permeável à membrana e carregada positivamente, entra nas células e se liga às proteínas aniônicas e ao DNA, conferindo assim uma cor roxa às células.

Em seguida, adicione etanol para solubilizar a mancha que não reagiu. Lave para remover qualquer excesso de mancha e seque o prato ao ar.

As colônias resistentes a medicamentos aparecem como pontos roxos. Conte o número de colônias coloridas em cada poço. Represente a porcentagem de viabilidade celular em um gráfico para determinar a proporção de células cancerígenas resistentes a medicamentos em cada concentração de medicamento.

Neste procedimento, coloque 2000 células, usando 2 mililitros de mídia por poço, nas placas de 6 poços. Após 24 horas, adicione concentrações crescentes de Docetaxel para as linhas celulares DU145 e 22Rv1. Adicione DMSO apenas a um poço como controle no mesmo volume usado para a dose mais alta de Docetaxel.

Após 72 horas, aspire o meio contendo o medicamento e adicione um novo meio sem docetaxel. Incube as placas por uma a duas semanas, até que as colônias sejam visíveis ao microscópio.

Para corar as colônias, lave-as suavemente com 2 a 3 mililitros de PBS e incube-as com dois a três mililitros de solução de cristal violeta por 20 minutos, dentro da capela de cultura de tecidos ou de uma capela de exaustão. Em seguida, remova a solução de coloração e lave as placas com 2 a 3 mililitros de água. Em seguida, remova a água e seque as placas ao ar.

Tire imagens digitais das placas para representação de figuras. Analise o resultado visualizando os poços e contando manualmente as colônias com a ajuda de uma caneta marcadora.