Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Técnicas Biológicas
0 visualizações • 3:37 min. • July 8th, 2025
Os enócitos larvais de Drosophila são células especializadas que se ligam na forma de aglomerados discretos na superfície basal da epiderme lateral - a camada superficial da pele. Esses enócitos estão envolvidos principalmente no metabolismo lipídico.
Durante a fome, esses enócitos acumulam gotículas lipídicas em excesso. Cada gota consiste em um núcleo hidrofóbico de lipídios neutros, como triglicerídeos e ésteres de colesterol, cercado por uma monocamada de fosfolipídios.
Para visualizar as gotículas lipídicas, pegue uma seção dissecada da epiderme larval de Drosophila com enócitos anexados. Trate com um tampão de fixação contendo paraformaldeído para reticular as proteínas celulares como proteases e preservar a integridade estrutural dos enócitos. Remova o tampão de fixação. Incube com um corante fluorescente à base de BODIPY no escuro para evitar o fotobranqueamento.
Durante a incubação, o corante apolar se difunde através da membrana celular dos enócitos e atravessa a monocamada ao redor das gotículas lipídicas. A hidrofobicidade das moléculas do corante permite que seu movimento para o núcleo apolar das gotículas lipídicas se ligue aos lipídios neutros.
Monte a amostra em uma lâmina, com os enócitos tocando a lâmina microscópica para uma visualização clara. Sele a amostra com uma lamínula e observe ao microscópio de fluorescência.
Após a excitação por luz azul em um comprimento de onda de quatro noventa e três nanômetros, o corante emite fluorescência verde a quinhentos e três nanômetros. Manchas fluorescentes verdes confirmam a presença de gotículas lipídicas.
Para coloração de gotículas lipídicas, incubar a epiderme dissecada em tampão de fixação, por 30 minutos em temperatura ambiente em um rotador, seguido de uma ressuspensão rápida em 1 mililitro de PBS. Em seguida, lave as amostras com três lavagens de 5 minutos em 1 mililitro de PBS por lavagem, para remover qualquer fixador residual.
Após a última lavagem, incubar as amostras epidérmicas com uma sonda lipofílica apropriada por 30 minutos à temperatura ambiente em um rotador. Durante a incubação, embrulhe os tubos de amostra em papel alumínio para proteger os tecidos da luz e lave as amostras três vezes em 1 mililitro de PBS por 10 minutos por lavagem.
Para obter imagens dos enócitos, transfira cada amostra de epiderme para 6 microlitros de meio de montagem em uma lâmina de microscópio limpa. Ajustar a orientação do tecido de modo a que a superfície interna que contém os enócitos toque na parte inferior da lâmina. Coloque suavemente uma lamínula na epiderme e sele as bordas com esmalte transparente. Quando o polimento secar, obtenha imagens das amostras em um microscópio confocal com uma ampliação de 63X com os comprimentos de onda de excitação e emissão apropriados.