Coloração de fosfatase ácida resistente ao tartarato: uma técnica in vitro para detectar osteoclastos cultivados contendo enzimas TRAP

Os osteoclastos são células grandes, em forma de cúpula e multinucleadas encontradas na superfície óssea. Essas células contêm numerosos grânulos citoplasmáticos ricos em fosfatase ácida resistente ao tartarato, ou TRAP - uma enzima metaloproteica secretada da borda eriçada dos osteoclastos para o tecido ósseo. Essa enzima digere a matriz extracelular e dissolve os cristais minerais, facilitando a reabsorção óssea.

Para detectar grânulos TRAP como marcadores citoquímicos de osteoclastos, pegue uma placa de cultura contendo osteoclastos aderentes. Adicione a solução de coloração TRAP às células. Esta solução compreende o substrato - um derivado de naftol contendo fosfato e ácido tartárico em um tampão suplementado com um sal de diazônio.

Adicione ácido acético a esta solução para manter o pH ácido necessário para a coloração TRAP. Incube as células no escuro à temperatura fisiológica para otimizar a atividade da enzima TRAP.

A solução de coloração entra nos osteoclastos, onde o ácido tartárico inibe a atividade hidrolisante de fosfatases ácidas sensíveis ao tartarato em outras células.

Ao mesmo tempo, o TRAP hidrolisa o substrato adicionado para remover seu grupo fosfato. O substrat