Coloração de fosfatase ácida resistente ao tartarato: uma técnica in vitro para detectar osteoclastos cultivados contendo enzimas TRAP

Os osteoclastos são células grandes, em forma de cúpula e multinucleadas encontradas na superfície óssea. Essas células contêm numerosos grânulos citoplasmáticos ricos em fosfatase ácida resistente ao tartarato, ou TRAP - uma enzima metaloproteica secretada da borda eriçada dos osteoclastos para o tecido ósseo. Essa enzima digere a matriz extracelular e dissolve os cristais minerais, facilitando a reabsorção óssea.

Para detectar grânulos TRAP como marcadores citoquímicos de osteoclastos, pegue uma placa de cultura contendo osteoclastos aderentes. Adicione a solução de coloração TRAP às células. Esta solução compreende o substrato - um derivado de naftol contendo fosfato e ácido tartárico em um tampão suplementado com um sal de diazônio.

Adicione ácido acético a esta solução para manter o pH ácido necessário para a coloração TRAP. Incube as células no escuro à temperatura fisiológica para otimizar a atividade da enzima TRAP.

A solução de coloração entra nos osteoclastos, onde o ácido tartárico inibe a atividade hidrolisante de fosfatases ácidas sensíveis ao tartarato em outras células.

Ao mesmo tempo, o TRAP hidrolisa o substrato adicionado para remover seu grupo fosfato. O substrato hidrolisado se acopla a um sal de diazônio da solução de coloração para formar um complexo de corante insolúvel de cor marrom. Este complexo precipita como grânulos nos locais de atividade enzimática.

Visualize as células sob um microscópio. A deposição de grânulos de corante marrom dentro do citoplasma confirma a presença de osteoclastos contendo TRAP na cultura.

Nesta etapa, aspire o meio e lave a amostra suavemente três vezes com 1X PBS. Em seguida, fixe as células em cada poço da placa de 96 poços com 100 microlitros de solução fixa por 30 segundos em temperatura ambiente.

Após a fixação, aspirar a solução fixa e lavar as células suavemente três vezes com água deionizada, pré-aquecida a 37 graus Celsius. Em seguida, aspire a água deionizada e adicione 100 microlitros de coloração TRAP em cada poço da placa de 96 poços.

Coloque a placa em uma incubadora a 37 graus Celsius por 30 minutos e proteja-a da luz. Após a coloração, aspire a mancha TRAP e lave suavemente três vezes com água deionizada. Posteriormente, imagem dos osteoclastos em microscópio invertido com ampliação de 40X.