Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Técnicas Biológicas
0 visualizações • 3:15 min. • July 8th, 2025
Os glicosaminoglicanos sulfatados, GAGs, são polissacarídeos lineares longos, carregados negativamente, com cadeias unitárias de dissacarídeos repetidas sulfatadas em posições distintas, existindo em comprimentos variados.
Para visualizar GAGs sulfatados isolados de interesse diferindo no comprimento da cadeia em um gel de poliacrilamida após eletroforese, remova cuidadosamente o gel de seu. Enxágue com água deionizada, removendo pedaços de gel presos que podem interferir na coloração.
Trate com uma solução ácida de azul de Alcian. Sob condições ácidas, o azul de Alcian, um corante catiônico polivalente com um átomo de cobre no centro, interage especificamente com GAGs sulfatados carregados negativamente por meio de interações iônicas, formando um complexo insolúvel em água azul profundo.
Lave o gel com água deionizada e metanol, removendo qualquer mancha residual. Incube o gel com uma solução alcalina de nitrato de prata. Sob condições alcalinas, os GAGs sulfatados ligados ao azul de Alcian fornecem locais para íons de prata carregados positivamente se ligarem e formarem complexos.
Trate o gel em uma solução de revelação contendo formaldeído e ácido cítrico. O ácido cítrico reduz o pH local para uma atividade ideal do formaldeído, o que reduz os íons de prata a prata metálica insolúvel dentro dos fragmentos de GAG sulfatados, amplificando o sinal azul de Alcian.
Adicione uma solução de parada para diminuir o pH, evitando a redução de íons de prata para uma coloração mínima do fundo. Agora, imagine o gel.
As bandas de fragmentos de GAG sulfatados manchados de azul-prata Alcian aparecem marrom escuro ou preto, permitindo a visualização e determinação de alta sensibilidade dos comprimentos isolados da cadeia de polímero GAG.
Quando a execução estiver concluída, desmonte o e extraia cuidadosamente o gel em um recipiente grande e limpo cheio de água filtrada e deionizada. Em seguida, descarte a água e manche o gel com a solução de coloração azul de Alcian por cinco minutos. Descarte a mancha azul de Alcian e lave rapidamente duas a três vezes com água filtrada e deionizada até que a maior parte da solução de coloração azul de Alcian tenha sido removida.
Manchar o gel em solução de coloração de nitrato de prata em um recipiente fresco e limpo por 30 minutos. Em seguida, lave duas a três vezes por 30 minutos cada em água filtrada deionizada, para remover totalmente a solução de coloração de prata. Descarte a água e adicione a solução de revelação.
Observe cuidadosamente o gel quanto ao aparecimento de bandas. Dependendo da qualidade da mancha e da massa da amostra carregada, o desenvolvimento pode levar de alguns segundos a vários minutos. Assim que as bandas desejadas estiverem visíveis, descarte imediatamente a solução de revelação e lave o gel brevemente com a solução de parada.