Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Técnicas Biológicas
0 visualizações • 2:52 min. • July 8th, 2025
Os ensaios de formação de colônias medem a capacidade proliferativa das células de se transformarem em colônias.
Primeiro, a suspensão de células derivadas da medula óssea compreende eritrócitos e células mononucleares, incluindo células-tronco mesenquimais ou MSCs, em meio em uma placa de cultura e incubada. As CTMs aderem ao fundo da placa enquanto os eritrócitos e as células mononucleares permanecem em suspensão e são descartados.
Adicione meios frescos contendo fatores de crescimento para apoiar a sobrevivência das MSC. Dependendo de seu potencial proliferativo individual, as MSCs se replicam para formar colônias.
Em seguida, trate as colônias com metanol. O metanol permeabiliza as células, desloca a água do ambiente intracelular e desnatura as proteínas, preservando a arquitetura celular.
Incube as colônias fixas com solução de coloração Giemsa - uma mistura de produtos de oxidação de azul de metileno, principalmente azul B, um corante básico, e eosina Y, um corante ácido. Após a difusão nas células, os dímeros B azuis carregados positivamente se ligam via intercalação ao DNA carregado negativamente no núcleo, conferindo uma coloração azul.
Os monômeros de eosina Y carregados negativamente interagem com cargas positivas não neutralizadas em dímeros B azuis ligados, formando um 'complexo eosina-Y-azure-B', alterando a coloração do DNA manchado de azul para roxo.
No citoplasma rico em ribossomos, o azul B se liga ao RNA carregado negativamente, mas a penetração reduzida da eosina Y em ribossomos altamente densos impede a formação do complexo eosina-Y-azure-B, corando o RNA azul.
Agora, lave o prato com tampão para remover o excesso de manchas e seque ao ar. Conte o número de colônias, que aparecem como aglomerados de células com núcleos roxos e citoplasma azul.
Para realizar o ensaio de UFC, prepare 10 mililitros de solução de Giemsa por prato, usando água estéril para diluir a solução estoque de 1 a 10. Remova o meio da placa de cultura de células e use PBS para lavar cuidadosamente as células.
Com metanol puro, fixe as células à temperatura ambiente por 5 minutos, depois descarte o metanol e adicione a solução de Giemsa. Incube em uma câmara umidificada a 37 graus Celsius por 60 minutos. Após a incubação, use PBS para lavar as células duas vezes. Em seguida, seque o prato ao ar com a cabeça em uma toalha de papel. Com um marcador na parte de trás da placa, conte manualmente as colônias.