JoVE Encyclopedia of Experiments
Técnicas Biológicas
0 vistas • 3:03 min • July 8th, 2025
Na ferrugem do café, os esporos de Hemileia vastatrix - um fungo patogênico - pousam na superfície da planta e desenvolvem um tubo de germinação, iniciando assim uma infecção através das hifas.
Essas hifas se espalham dentro do tecido e invadem as células vegetais por meio de estruturas especializadas semelhantes a dedos chamadas haustórios, que absorvem os nutrientes da planta. Os haustórios também secretam moléculas efetoras que são reconhecidas pelas proteínas de resistência da planta, levando ao encapsulamento rico em pectina dos haustórios para restringir a infecção.
Para visualizar essa interação, comece com uma seção de folha de café infectada ultrafina, embebida em resina. Agora, trate a amostra com lactofenol azul de algodão - uma coloração histológica composta por fenol, ácido lático, glicerol e azul de algodão. Aqueça a lâmina brevemente.
À medida que os componentes do corante penetram no tecido, o fenol elimina quaisquer organismos vivos, enquanto o ácido lático e o glicerol ajudam a preservar a arquitetura celular. Simultaneamente, as moléculas de algodão azul se ligam às porções de quitina na parede celular do fungo e a mancham de azul.
Lave a amostra com água destilada. Em seguida, trate a amostra com corante vermelho de rutênio.
As moléculas de rutênio carregadas positivamente se ligam aos polissacarídeos carregados negativamente na parede celular vegetal rica em pectina e a mancham de vermelho. Novamente, lave a lâmina e visualize ao microscópio.
A parede celular da planta rica em pectina aparece vermelha, encapsulando os haustórios azuis que se estendem das hifas fúngicas azuis.
Corte o bloco em seções de 5 micrômetros de espessura usando um micrótomo rotativo equipado com lâminas de aço de 8 centímetros. Coloque as seções em lâminas de vidro cobertas com água destilada e, em seguida, transfira as lâminas para uma placa quente para secar a 40 graus Celsius e promova a adesão das seções às lâminas de vidro.
Após a secagem, rotule as lâminas de vidro com o nome de referência do bloco e o número da lâmina. Cubra as seções com 2 mililitros de 5% de algodão azul em lactofenol e aqueça-as em uma chapa quente a 45 graus Celsius por cinco minutos.
Retirar o excesso de corante lavando a lâmina três vezes num copo cheio de água destilada. Manchar com 2 mililitros de vermelho rutênio a 0,01% em água por um minuto.
Retirar o excesso de corante lavando a lâmina três vezes num copo cheio de água destilada. Coloque uma gota de água destilada sobre as seções e cubra as seções com uma lamínula para realizar a análise de microscopia de luz.