Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Técnicas Biológicas
0 visualizações • 4:48 min. • July 8th, 2025
A aterosclerose ocorre devido ao acúmulo de lipoproteínas no revestimento interno das artérias, resultando em acúmulo de placas, espessamento e estreitamento das artérias e redução do fluxo sanguíneo.
As placas consistem em uma capa fibrosa com células musculares lisas e matriz extracelular, envolvendo um núcleo composto por lipoproteínas de baixa densidade, LDLs - partículas esféricas com um núcleo hidrofóbico de ésteres de colesterol e triglicerídeos, circundados por uma camada externa de fosfolipídios - juntamente com células inflamatórias.
Para visualizar placas ateroscleróticas ricas em lipídios, obtenha um arco aórtico de camundongo recém-colhido. Transfira-o para uma plataforma personalizada de fundo escuro para melhorar o contraste durante imagens de área ampla. Adicione tampão para evitar a desidratação do tecido.
Remova o tecido adiposo perivascular ao redor do arco aórtico para evitar manchas de fundo falsas. Incisar a aorta e seus ramos longitudinalmente através do lúmen para expor a superfície mais interna com acúmulo de placa aterosclerótica.
Prenda o arco aórtico aberto na plataforma e incube em etanol. O etanol desloca a água do tecido, inativando proteínas e preservando a arquitetura do tecido.
Trate com corante Sudan IV solubilizado em solventes orgânicos. Dentro da placa, o Sudan IV, um corante diazo lipossolúvel com alta afinidade por triglicerídeos e ésteres de colesterol de lipoproteínas, passa da fase de solvente orgânico e se liga ao núcleo hidrofóbico de lipídios das LDLs, formando complexos estáveis. Lave o excesso de manchas com etanol.
Sob um estereomicroscópio, as placas ateroscleróticas ricas em lipídios coradas parecem vermelho-alaranjadas, enquanto as áreas sem placa parecem pálidas.
Para preparar um leito de fixação para análise facial, dobre um segmento de filme de cera de parafina 8 vezes para fazer uma superfície plana de 25 x 25 milímetros e enrole fita isolante elétrica preta ao redor do filme para fazer um fundo escuro para a aorta.
Coloque uma etiqueta na parte de trás da cama de fixação e use um lápis para anotar o número de identificação do mouse. Transfira o arco aórtico para o leito de fixação e adicione uma gota de PBS ao tecido. Usando um estereomicroscópio, limpe a aorta do tecido adiposo periadventício remanescente e use uma tesoura de Vannas e uma pinça Dumont para remover suavemente todo o tecido adiposo circundante sem manipular ou danificar a aorta.
Em seguida, introduza a tesoura de Vannas no lúmen aórtico para expor a superfície intimal. Comece a cortar a curvatura externa do arco ascendente na direção distal, continuando a abrir os ramos, incluindo a artéria braquiocefálica, e poupando a parte dorsal da região torácica descendente.
Para exibir a superfície intimal, abra a curvatura menor e abra a aorta. Usando um porta-agulha micro Castroviejo, prenda o arco aberto ao leito de pinos com a extremidade romba dos pinos de insetos minucianos sem esticar a amostra, dobrando suavemente os pinos para longe da amostra, enquanto o tecido é mantido no lugar. Em seguida, armazene o arco fixado com a face voltada para baixo em uma placa de Petri de PBS a 4 graus Celsius.
Para a coloração Sudan IV, enxágue a amostra por 5 minutos em uma placa de Petri de etanol a 70% com o arco voltado para baixo, antes de transferir a amostra para uma placa de solução de trabalho Sudan IV por 7 minutos.
No final da incubação, enxágue a amostra com duas lavagens de 3 minutos em etanol a 80% para desmanchar a superfície íntima normal, seguida de um enxágue final em PBS, antes de retornar o tecido à sua placa de Petri original. Em seguida, adquira micrografias sob um estereomicroscópio conectado a uma câmera digital com uma ampliação de 10X, obtendo imagens do arco fixado submerso em PBS, usando pequenos pesos de metal para segurar o leito de fixação no fundo da placa de Petri.