Ensaio de atividade enzimática baseado em cromatografia em camada fina: uma técnica para determinar a atividade da pirofosfoquinase in vitro usando cromatografia em camada fina

A pirofosfoquinase catalisa a transferência de difosfato ou pirofosfato do precursor de nucleotídeos, como trifosfato de adenosina, ATP, para substratos como difosfato de guanosina, GDP. Isso forma o tetrafosfato de guanosina - uma importante molécula de sinalização.

Para determinar a atividade da pirofosfoquinase, prepare uma mistura de reação compreendendo GDPs e ATPs radiomarcados em um tampão adequado suplementado com cloreto de magnésio. Adicione a quantidade desejada de pirofosfoquinase à mistura de reação e incuba.

Com o tempo, na presença de íons de magnésio, a pirofosfoquinase começa a transferir a porção pirofosfato radiomarcada do ATP para o GDP, produzindo tetrafosfato de guanosina radioativo.

Agora, pegue uma cromatografia em camada fina ou TLC, placa pré-revestida com polietilenimina Identifique alíquotas dos analitos da mistura de reação perto da base da placa de TLC em diferentes pontos de tempo para interromper a reação e avaliar o progresso.

Mergulhe a placa em uma câmara de vidro contendo fosfato de potássio monobásico - um solvente de fase móvel. À medida que a frente do solvente se move para cima, os analitos carregados negativamente começam a migrar com base em suas afinidades com a fase estacionária carregada positivamente.

As diferenças nas cargas negativas e no peso de analitos fosforilados de forma diferente determinam sua migração relativa na placa TLC, permitindo que eles se imobilizem como bandas distintas.

Quando a frente do solvente atingir a distância desejada, remova a placa e seque ao ar. Meça a intensidade do sinal radioativo, correspondendo à depleção de ATP marcada radioativamente e ao acúmulo de tetrafosfato de guanosina para analisar a atividade da pirofosfoquinase.

Antes de realizar a reação, prepare placas de cromatografia de camada fina de PEI-celulose lavando-as em água deionizada. Coloque as placas em uma câmara de vidro com água bidestilada Depois de permitir que a água migre para o topo da placa, retire as placas da câmara de vidro e deixe secar em uma prateleira de bancada durante a noite.

Marque as placas secas a 2 centímetros de uma borda com um lápis macio, para indicar onde as amostras serão aplicadas para TLC. Para amostras de 2 microlitros, aplique amostras com pelo menos 1 centímetro de distância. Ao planejar experimentos, sempre deixe um ponto em cada placa sem uso, para servir como uma pista em branco para quantificação da amostra.

Para realizar o ensaio de atividade enzimática, prepare reações individuais usando ^γ-32P-ATP, conforme descrito no protocolo de texto. Adicione o RSH após os outros componentes terem sido misturados, pois a adição de RSH à mistura contendo nucleotídeos inicia o ensaio de atividade enzimática.

Para controlar a hidrólise do ATP da atividade contaminante da nuclease, monte uma reação de 10 microlitros sem proteína e incuba-a em paralelo. Identifique amostras de 2 microlitros em t = 0 e no final do experimento para garantir que o ATP não foi hidrolisado na ausência de proteína.

Imediatamente após a adição de RSH, remova 2 microlitros e coloque-o na placa de PEI-celulose rotulada como a amostra t = 0 minuto.

Incube a reação a 37 graus Celsius, removendo alíquotas de 2 microlitros nos pontos de tempo desejados. Depois que todas as alíquotas forem coletadas, execute a cromatografia em camada fina enchendo a câmara de cromatografia com fosfato de potássio monobásico 1,5 molar a uma profundidade de 0,5 centímetros. Mergulhe a borda inferior da placa em solvente e deixe o solvente migrar para o topo da placa por aproximadamente 90 minutos.

Remova a placa do tanque de cromatografia e coloque-a em um escorredor de bancada para secar ao ar durante a noite. Depois que a placa estiver seca, envolva-a em filme plástico para evitar a transferência de material radioativo para o de imagem e analise por autorradiografia.

Expor a placa de PEI-celulose que contém as reacções separadas a uma de imagem fosforosa durante quatro horas à temperatura ambiente. Após a exposição, crie uma imagem do em um gerador de imagens de fósforo.

Usando um software de imagem com uma interface gráfica do usuário, desenhe regiões de interesse ou ROIs, selecionando primeiro "Desenhar retângulo". Em seguida, use o mouse para desenhar ROIs retangulares em torno de uma pista inteira e os pontos de ATP e tetrafosfato de guanosina contidos nessa pista.

Use os comandos "Selecionar, copiar e colar" para desenhar ROIs idênticas nas outras raias, para garantir que as ROIs estejam medindo sinais em áreas idênticas em cada raia. Inclua ROIs de uma pista não utilizada para serem usados como espaços em branco.

Usando o botão "Analisar | Ferramentas | Gerente de ROI | Adicionar" comandos do software de imagem, selecione todas as ROIs desenhadas na placa de PEI-celulose. Agora, use o botão "Analisar | Definir Medidas | Medir" para quantificar a intensidade do sinal dentro de cada ROI e exportar as medições como uma planilha. Na planilha, subtraia os valores de ROI em branco dos sinais experimentais.