Ensaio de atividade enzimática baseado em cromatografia em camada fina: uma técnica para determinar a atividade da pirofosfoquinase in vitro usando cromatografia em camada fina

A pirofosfoquinase catalisa a transferência de difosfato ou pirofosfato do precursor de nucleotídeos, como trifosfato de adenosina, ATP, para substratos como difosfato de guanosina, GDP. Isso forma o tetrafosfato de guanosina - uma importante molécula de sinalização.

Para determinar a atividade da pirofosfoquinase, prepare uma mistura de reação compreendendo GDPs e ATPs radiomarcados em um tampão adequado suplementado com cloreto de magnésio. Adicione a quantidade desejada de pirofosfoquinase à mistura de reação e incuba.

Com o tempo, na presença de íons de magnésio, a pirofosfoquinase começa a transferir a porção pirofosfato radiomarcada do ATP para o GDP, produzindo tetrafosfato de guanosina radioativo.

Agora, pegue uma cromatografia em camada fina ou TLC, placa pré-revestida com polietilenimina Identifique alíquotas dos analitos da mistura de reação perto da base da placa de TLC em diferentes pontos de tempo para interromper a reação e avaliar o progresso.

Mergulhe a placa em uma câmara de vidro contendo fosfato de potássio monobásico - um solvente de fase móvel. À medida que a frente do solvente se move para cima, os analitos carregados negativamente começam a migrar com base e