Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Técnicas Biológicas
0 visualizações • 3:10 min. • July 8th, 2025
Comece tratando a amostra de proteína com um tampão desnaturante composto por um detergente - dodecil sulfato de sódio, SDS e um agente redutor - beta-mercaptoetanol. Aqueça-o brevemente. Durante esta etapa, o beta-mercaptoetanol interrompe as ligações dissulfeto, tornando uma conformação desdobrada à proteína.
As proteínas desdobradas com seus aminoácidos hidrofóbicos expostos se ligam ao SDS carregado negativamente e adquirem uma carga negativa uniforme. Adicione um corante de rastreamento adequado à amostra para visualização em tempo real.
Agora, carregue a amostra e o marcador de tamanho molecular padrão em poços separados presentes no gel de empilhamento - a camada superior do gel de poliacrilamida contendo uma concentração mais baixa de polímeros de acrilamida reticulada.
Conecte o aparelho de gel cheio de tampão à fonte de alimentação.
Na presença de um campo elétrico, as proteínas carregadas negativamente migram livremente em direção ao ânodo e se empilham para entrar no gel de resolução - a camada inferior contendo um gel de concentração mais alta.
No gel de resolução, as proteínas começam a migrar de acordo com seu tamanho molecular, com proteínas menores migrando rapidamente, resultando em bandas de proteínas resolvidas de maneira ideal. Depois disso, pare a corrida e remova o gel.
Manchar o gel com um corante aniônico, azul de Coomassie, que se liga eletrostaticamente aos aminoácidos básicos das proteínas, conferindo-lhes coloração azul. Em seguida, retire o gel em solução de ácido acético para melhor visualização.
Remova o gel e identifique as proteínas separadas com base em seus pesos moleculares estimados.
Prepare dois géis separadores conforme descrito no manuscrito do texto. Despeje o gel entre as placas de vidro usando uma pipeta de 1 mililitro, garantindo que os 2 centímetros superiores estejam livres da mistura. Adicione etanol 70% em cima do gel separador, criando uma interface uniforme entre as duas camadas.
Uma vez que os géis de separação tenham polimerizado, prepare os géis de empilhamento usando as instruções do manuscrito do texto. Em seguida, remova o etanol dos géis de separação e adicione a solução de gel de empilhamento. Insira cuidadosamente um pente com o número desejado de bolsas, sem introduzir bolhas de ar, e deixe o gel polimerizar por 20 a 30 minutos.
Carregue 4 microlitros de cada amostra, bem como a escada de proteínas, em poços separados. Em seguida, execute o gel em tampão de corrida Tris-Glicina a 144 volts por 45 minutos em temperatura ambiente. Use a solução Fairbanks A pré-aquecida para manchar os géis em um balancim por 30 minutos e a solução Fairbanks D pré-aquecida para descolorir os géis em um balancim até que o fundo desejado seja alcançado.