A aplicação de ligadura da artéria Cerebral Média Permanente no mouse
25 de julho de 2011
Ligadura da artéria cerebral média (MCA) é uma técnica para estudo da isquemia cerebral focal em modelos animais. Neste método, o da artéria cerebral média é exposto por craniotomia e ligados por cauterização. Este método dá volumes infarto altamente reprodutível e aumentou as taxas de sobrevivência pós-operatória em comparação com outros métodos disponíveis.
O objetivo geral deste procedimento é estudar a isquemia cerebral focal em modelos animais. Isso é realizado inicialmente fazendo uma pequena incisão na pele entre o olho esquerdo e a base da orelha. Em seguida, realiza-se uma craniotomia na junção do arco zigomático e do osso esquamoso para expor a artéria cerebral média, que então é ligada usando um cauterizador de pequenos vasos.
Por fim, a pele é suturada para fechar a ferida. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram um infarto localizado no hemisfério esquerdo do cérebro do camundongo. O cérebro pode ser corado com TTC ou escaneado utilizando ressonância magnética para a visualização de um acidente vascular cerebral.
O cérebro após acidente vascular cerebral também pode ser utilizado para determinação da expressão de proteínas ou de mRNA. Olá, sou Garza Chola. Sou estudante de pós-graduação no laboratório de Gale Johnson na Universidade de Rochester.
Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de acidente vascular cerebral, como ilustrar os mecanismos que levam à morte celular no cérebro isquêmico. Para se preparar para a cirurgia, esterilize todos os instrumentos cirúrgicos, esponjas de gaze e aplicadores cognitivos por autoclave. Mantenha os instrumentos cirúrgicos em etanol 70% durante a cirurgia e deixe secar ao ar sobre gaze estéril imediatamente antes do uso.
Pulverize a área de trabalho com etanol 70% duas horas antes da cirurgia. Injete o camundongo com 0,05 miligramas por quilograma de buprenorfina. A droga será administrada novamente imediatamente após a cirurgia e, em seguida, a cada três a cinco horas durante as primeiras 24 horas do período pós-operatório.
Use um vaporizador de anestésico para anestesiar o camundongo com uma mistura de 3% de ISO e 20% de oxigênio. Ajuste a quantidade de oxigênio com um medidor de fluxo. Teste o nível de anestesia por meio de pinçamento do dedo do pé ou da cauda.
Mantenha o nível de anestesia com 2% de ISO fluoreto. Aplique lágrimas artificiais nos olhos do camundongo e tenha cuidado para não danificar o olho durante o procedimento cirúrgico.
Coloque o camundongo em decúbito lateral direito utilizando os tesourões para animais. Apare a região do lado esquerdo entre o olho esquerdo e a base da orelha esquerda. Limpe a área alternando uma solução de Betadine e etanol 70% utilizando aplicadores de algodão e friccionando levemente a região.
A repetição é necessária. Coloque o camundongo sobre uma placa aquecida conectada a uma sonda retal; para manter a temperatura corporal a 37 graus Celsius, insira a sonda retal utilizando óleo mineral. Posicione o camundongo sobre o lado direito sob o microscópio e fixe com fita adesiva.
Corte uma janela em uma esponja de gaze e cubra a área cirúrgica com uma tesoura fina reta. Faça uma incisão vertical entre o olho esquerdo e a base da orelha esquerda. Use hemostatos curvos para manter a área cirúrgica aberta caso ocorra secagem excessiva do tecido durante a cirurgia.
Use aplicadores de algodão para aplicar PBS estéril. Use tesoura de mola para fazer uma incisão horizontal no músculo temporal e puxe lentamente com pinça para separar levemente o músculo temporal do crânio. Segure o maxilar com pinça curva e use uma agulha de calibre 18 para fazer uma pequena craniotomia subtemporal na junção do arco zigomático e do osso esquamoso.
Com uma serra óssea, os cirurgiões removem pequenos fragmentos do crânio para expor a artéria cerebral média (MCA). A arcada zigomática e o conteúdo orbitário não devem ser danificados durante esse procedimento. Utilizando um cauterizador para pequenos vasos, ligue a porção distal da MCA, reposicione o músculo temporal em sua posição original e utilize suturas de náilon 5-0.
Para fechar o local da incisão, interrompa a anestesia e remova a sonda retal. Injete o camundongo com uma segunda dose de buprenorfina por via subcutânea. Devolva o camundongo à gaiola, que foi mantida a 37 graus Celsius.
Com um painel de aquecimento. Monitore atentamente o camundongo nas próximas 24 horas quanto a qualquer desconforto, incluindo diminuição do apetite ou consumo de água, postura curvada, aumento da respiração ou piloereção. Forneça ao camundongo gel de recuperação imediatamente após a cirurgia.
Aguarde duas a três horas após a cirurgia. Em seguida, injete o camundongo com buprenorfina por via subcutânea a cada três a cinco horas, até 24 horas. Vinte e quatro horas após a cirurgia, anestesie profundamente o camundongo e realize a perfusão do camundongo com TTC a 4%.
Remova o cérebro e coloque-o em uma solução de paraformaldeído 4% durante a noite. No dia seguinte, posicione o cérebro no bloco de corte. Utilize lâminas de barbear para cortar o cérebro em fatias com espessura de um milímetro.
Coloque as fatias ao lado de uma régua de escala milimétrica. Utilizando uma câmera digital conectada a um microscópio estereoscópico, fotografe as fatias no software Image J.
Clique no menu de arquivo e abra a foto desejada. Clique na aba de linha reta no programa. Desenhe uma linha reta entre as duas margens da régua.
Clique no menu analisar e selecione definir escala. Defina a distância conhecida como um e a unidade de comprimento como milímetro. Clique na aba círculo desenhado à mão livre.
Desenhe um círculo para delimitar o hemisfério contralateral. Clique no menu analisar e selecione medir. A janela de cálculo será exibida, mostrando a área do círculo desenhado.
Desenhe outro círculo ao redor do hemisfério ipsilateral, excluindo a área com traçado branco. Meça a área conforme mostrado anteriormente. O novo valor será adicionado à janela de cálculo.
A diferença entre o primeiro e o segundo valor representa a área do infarto. Calcule a área do acidente vascular cerebral em cada corte repetindo os passos acima para espessuras de corte de um milímetro. Calcule o volume do acidente vascular cerebral somando as áreas do acidente vascular cerebral calculadas em cada corte.
Esta figura mostra o cérebro corado com TTC 24 horas após a ligadura permanente da artéria cerebral média em um camundongo selvagem da linhagem C57BL/6. O local do acidente vascular cerebral apresenta-se branco e pode ser observado em diferentes ampliações e ângulos. São mostrados aqui cortes de um milímetro de espessura do cérebro com acidente vascular cerebral corado com TTC, do infarto anterior ao posterior.
O volume foi calculado 24 horas após a cirurgia. O volume do infarto é de aproximadamente 23 milímetros cúbicos Uma vez mostarda. Esta técnica pode ser realizada em 30 minutos se for executada corretamente.
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Visão Geral
A técnica de ligadura da artéria cerebral média (ACM) é utilizada para estudar a isquemia cerebral focal em modelos animais. Este método envolve a exposição e ligadura da artéria cerebral média, resultando em volumes de infarto reprodutíveis e taxas de sobrevida pós-operatória melhoradas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Pesquisa sobre AVC
- Modelos Animais
Antecedentes
- A isquemia cerebral focal é uma área crítica de estudo para a compreensão do acidente vascular cerebral.
- O método de ligadura da ACM permite experimentação controlada.
- Modelos animais fornecem informações sobre os mecanismos do acidente vascular cerebral humano.
- A melhoria nas taxas de sobrevivência aumenta a confiabilidade dos resultados.
Objetivo do Estudo
- Investigar os efeitos da isquemia cerebral focal.
- Avaliar os volumes de infarto em um ambiente controlado.
- Aprimorar o entendimento da patologia do acidente vascular cerebral.
Métodos Utilizados
- Incisão feita entre o olho esquerdo e a base da orelha.
- Craniotomia realizada no arco zigomático e no osso esquamal.
- Artéria cerebral média ligada utilizando um cauterizador de pequenos vasos.
- Pele suturada para fechar a ferida após o procedimento.
Resultados Principais
- Infarto localizado no hemisfério esquerdo do cérebro do camundongo.
- Visualização do acidente vascular cerebral obtida por meio da coloração com TTC ou por ressonância magnética.
- Os resultados demonstram a eficácia da técnica de ligadura da artéria cerebral média.
- Alta reprodutibilidade dos volumes de infarto observada.
Conclusões
- A ligadura da ACM é um método confiável para estudar a isquemia cerebral focal.
- As taxas de sobrevivência aumentadas contribuem para a validade dos resultados.
- Essa técnica pode ser utilizada para avançar a pesquisa sobre terapias para acidente vascular cerebral.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O modelo de ligadura permanente da artéria cerebral média fornece um sistema reprodutível para o estudo da isquemia cerebral focal, permitindo a redução de riscos mecanicistas de compostos neuroprotetores na pesquisa pré-clínica de acidente vascular cerebral. Ao gerar volumes de infarto consistentes em camundongos, este método apoia a validação de alvos e o desenvolvimento de ensaios para candidatos terapêuticos direcionados a necessidades não atendidas no acidente vascular cerebral isquêmico. Sua relevância para a patologia humana—onde cerca de 80% dos acidentes vasculares cerebrais ocorrem na região da artéria cerebral média—reforça a confiança translacional e a triagem de portfólios na fase inicial de descoberta.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas em vias isquêmicas mediante indução controlada de isquemia focal.
- Valor Científico: Apoia a desmistificação biológica ao esclarecer o envolvimento do alvo na formação do núcleo de infarto e da penumbra.
- Valor Operacional: Oferece quantificação reprodutível de infartos por meio da coloração com TTC, facilitando a avaliação consistente do engajamento do alvo.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados para triagem de compostos ao estabelecer um modelo de isquemia relevante para a doença.
- Valor Operacional: Padroniza a medição de infarto por meio da volumetria baseada em TTC, permitindo análise quantitativa de resposta à dose.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade do ensaio com taxas de sobrevida de aproximadamente 80%, reduzindo a variabilidade nos resultados farmacológicos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Modela a patologia do acidente vascular cerebral com alta relevância anatômica e fisiopatológica para infartos na região da artéria cerebral média.
- Valor Científico: Permite a avaliação in vivo dos mecanismos de resposta intracelular à hipóxia, apoiando a descoberta de biomarcadores.
- Valor Operacional: Oferece continuidade do estágio de descoberta à validação pré-clínica por meio de protocolos cirúrgicos e de coloração padronizados.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método integra-se ao continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a identificação de compostos líderes e os testes de eficácia pré-clínica, fornecendo uma plataforma para a redução de riscos mecanicistas de terapêuticos para acidente vascular cerebral.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre alvos neuroprotetores ao permitir lesão isquêmica controlada e quantificação do infarto.
- Triagem: Oferece prontidão para ensaios por meio da coloração padronizada com TTC, gerando saídas quantitativas de volume de infarto para avaliação de compostos.
- Análises: Produz medidas volumétricas (por exemplo, infarto de ~23 mm³ em 24 h) que permitem comparação entre condições e determinação do tamanho do efeito.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica por meio da localização do infarto que espelha os padrões de acidente vascular cerebral humano, auxiliando o avanço com ajuste de risco.
- Reutilização Corporativa: Funciona como uma plataforma reutilizável para avaliação de múltiplos compostos em diversos projetos, devido à sua reprodutibilidade e pontos finais padronizados.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista nas vias isquêmicas.
- Valor Operacional: Garante a reprodutibilidade por meio de procedimentos padronizados de craniotomia, ligadura e coloração com TTC.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avançar/interromper ao fornecer dados confiáveis sobre infarto, reduzindo o risco biológico em estágios avançados nos programas de acidente vascular cerebral.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de candidatos neuroprotetores com base em sinais de eficácia pré-clínica consistentes.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em microcirurgia de roedores e identificação neuroanatômica da ACA.
- Depende de instrumentação microcirúrgica, incluindo cauterizadores vasculares, placas de aquecimento e ferramentas de sutura de precisão.
- Necessita padronização entre equipes dos protocolos de anestesia, analgesia e monitoramento pós-operatório.
- Envolve considerações de adaptação ao transferir as técnicas de modelos ratos para modelos camundongos, incluindo o tamanho da sutura e a precisão da oclusão.
- Limitado pela necessidade de pontos experimentais terminais para realizar a quantificação do infarto por meio de coloração com TTC ou ressonância magnética.
