Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Técnicas Biológicas
0 visualizações • 4:02 min. • July 8th, 2025
As septinas são proteínas-chave do citoesqueleto que se ligam às superfícies curvas da membrana plasmática.
Para observar in vitro a montagem de septinas em microesferas, primeiro, pegue uma suspensão de esferas de sílica microscópicas de tamanho uniforme, atuando como suporte sólido para a formação de bicamadas. Vortex esta suspensão para quebrar quaisquer aglomerados de contas.
Complemente-o com pequenas vesículas unilamelares, SUVs - vesículas esféricas cercadas por uma única bicamada lipídica. Incubar com agitação constante, evitando que as microesferas se assentem.
Durante a incubação, os grupos de cabeça polar externa facilitam a adsorção de SUVs na superfície da microesfera hidrofílica. Essa interação faz com que os SUVs se rompam, seguidos pela fusão de lipídios SUV na superfície curva da microesfera como uma camada contínua, resultando em uma bicamada lipídica esférica suportada, SLB, formação.
Lave para remover o excesso de lipídios não ligados e ressuspenda no tampão de reação. Transfira a suspensão esférica SLB para uma pequena região de uma superfície revestida de polietilenoglicol, para evitar adsorções inespecíficas. Adicione uma suspensão de septina marcada com fluorescência à câmara e incube.
As septinas formam hetero-oligômeros que reconhecem a curvatura positiva dos SLBs esféricos, polimerizando-se para formar filamentos. Eventualmente, os filamentos de septina interagem uns com os outros, levando à formação de estruturas de ordem superior.
Observe SLBs revestidos de septina sob um microscópio de fluorescência de alta resolução. A presença de fluorescência indica a deposição sensível à curvatura da septina.
Primeiro, vórtice a garrafa contendo microesferas de sílica por 15 segundos. Em seguida, bata-sonice por um minuto e votice novamente por 15 segundos para quebrar quaisquer aglomerados. Misture as esferas com SLBB e 10 microlitros de SUVs de 5 milimolares em um tubo de microcentrífuga de baixa adesão.
Incube a mistura de grânulos e lipídios por uma hora em temperatura ambiente, em um agitador para evitar sedimentação. Enquanto isso, descongele uma lamínula PEGulada e cole um tubo de PCR de 0,2 mililitro cortado nela. Após a incubação, centrifugue os grânulos por 30 segundos no RCF designado.
Após a primeira centrifugação, retire 50 microlitros de sobrenadante. Em seguida, adicione 200 microlitros de PRB e misture por pipetagem vigorosa. Para as próximas rodadas, remova 200 microlitros de PRB e adicione mais 200 microlitros após a segunda e terceira centrifugação e adicione 220 microlitros de PRB após a quarta centrifugação.
Se estiver fazendo um ensaio de competição com vários tamanhos de grânulos, prepare a reação misturando volumes iguais de cada tamanho de grânulo e diluindo 29 microlitros dessa mistura de grânulos com 721 microlitros de tampão de reação. Em seguida, adicione 75 microlitros de grânulos diluídos e 25 microlitros da proteína diluída em SSB aos poços e misture.
Se medir septinas em um estado estacionário, incube a mistura em temperatura ambiente por uma hora e, em seguida, faça a imagem por microscopia próxima ao TIRF ou confocal.