Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Técnicas Biológicas
0 visualizações • 3:27 min. • July 8th, 2025
A biomassa é uma matéria orgânica derivada de plantas composta principalmente de polissacarídeos complexos. As enzimas degradadoras de carboidratos atuam sobre esses polissacarídeos para produzir oligossacarídeos menores.
Para avaliar a atividade de degradação de uma enzima, comece tomando diferentes substratos de biomassa cromogênica insolúvel - ICB presentes nos poços de uma placa de reação porosa. Esses substratos são obtidos a partir do tingimento de materiais derivados de plantas com um corante clorotriazina de cor específica. A biomassa resultante tem polissacarídeos complexos marcados com corante que servem como substrato para a atividade enzimática.
Agora, adicione uma solução tampão contendo enzima hidrolisadora de carboidratos. O tampão mantém o pH para uma atividade enzimática ideal. Coloque a placa de reação em um shaker e incuba. A agitação constante permite que as moléculas enzimáticas atinjam o polissacarídeo alvo no substrato ICB.
Durante a incubação, a enzima hidrolisadora cliva as ligações glicosídicas covalentes dentro dos polissacarídeos de cadeia longa. A reação produz oligossacarídeos solúveis ligados a moléculas de corante, que permanecem na solução.
Após a conclusão da degradação, coloque a placa de reação em cima de uma placa de produto e centrifugue o conjunto. Durante a centrifugação, a solução colorida contendo produtos de reação passa pelo filtro na parte inferior da placa e é coletada na placa do produto. Usando um leitor de placas, registre a absorbância do sobrenadante.
Um valor de absorbância mais alto denota a geração de um grande número de oligossacarídeos ligados a corantes - indicando a eficiência da enzima na degradação do substrato ICB.
Para realizar o ensaio cromogênico com Biomassa Cromogênica Insolúvel vermelha, ou palha de trigo ICB, comece adicionando 200 microlitros de solução de ativação a cada poço da placa de ensaio. Em seguida, incube a placa em temperatura ambiente, sem agitação, por 10 minutos.
Remova o estabilizador usando 100 microlitros de água estéril para lavar os poços três vezes. Em seguida, adicione 150 microlitros de tampão acetato de sódio 100 milimolares, pH 4,5, e 5 microlitros de 10 unidades por mililitro de solução de endoxilanase diferente.
Posicione a placa do produto embaixo da placa do substrato para coletar qualquer vazamento potencial da placa do substrato durante a agitação e incube a reação em temperatura ambiente e 100 RPM por 2 horas.
Após a incubação, coloque a placa do kit de ensaio, com a placa do produto embaixo dela, na centrífuga e gire a 2.700 x g por 10 minutos para transferir o produto da reação nos poços da placa do produto.
Verifique se o volume de líquido em cada poço é aproximadamente o mesmo. Em seguida, usando um leitor de placas, leia a absorbância da placa de coleta em 517 nanômetros para palha de trigo ICB vermelha.