Ação Capilar Radial Diferencial do Ensaio de Ligante: Uma Técnica de Alto Rendimento para Identificar Proteínas Intracelulares de Ligação ao Segundo Mensageiro de Nucleotídeos Bacterianos

As bactérias produzem segundos mensageiros de nucleotídeos, NSMs - moléculas de sinalização intracelular - em resposta a estímulos apropriados. Essas moléculas se ligam a proteínas-alvo e regulam as funções bacterianas.

Para identificar essas proteínas-alvo usando a ação capilar radial diferencial do ensaio do ligante, pegue uma placa de vários poços com lisado de células bacterianas contendo proteínas solúveis. Essas proteínas são derivadas de diferentes clones bacterianos que expressam ORFs individuais - quadros de leitura abertos - no genoma, garantindo que cada poço tenha uma proteína distinta.

Adicione uma mistura de guanosina tetra e pentafosfatos - NSMs marcados com fósforo radioativo. Essas moléculas se ligam a proteínas-alvo no lisado. Com uma ferramenta de alfinetes, colete uma quantidade igual de líquido de cada poço. Coloque a ferramenta em uma membrana de nitrocelulose para depositar o líquido como manchas.

As proteínas-alvo se ligam à membrana por meio de interações não covalentes, impedindo sua difusão. Isso sequestra os NSMs radiomarcados ligados no ponto central de aplicação. Os NSMs livres difundem-se radialmente com a fase líquida por ação capilar.

Use imagens de fósforo para detectar os sinais radioativos e obter uma imagem digital das manchas. Defina os pontos usando dois círculos. O externo retrata a periferia dos NSMs difusos. O círculo interno representa os NSMs sequestrados.

Calcule a fração de ligação - a intensidade da radioatividade detectada do círculo interno sobre a radioatividade total da mancha difusa. Localize pontos com altas frações de ligação para identificar os poços com proteínas-alvo ligadas ao NSM.

Para a triagem DRaCALA das proteínas-alvo, adicione 20 microlitros dos lisados de células inteiras descongelados a poços individuais de uma placa de microtitulação de fundo em V de 96 poços e adicione 2,5 unidades de endonuclease de Serratia marcescens a cada poço. Após 15 minutos a 37 graus Celsius, coloque os lisados no gelo por 20 minutos.

Em seguida, misture volumes iguais de pentafosfato de guanosina marcado com fósforo 32 e tetrafosfato de guanosina e adicione 1x tampão de lise # 1 à mistura para obter uma solução de pentafosfato de guanosina de quatro nanomolares.

Usando uma pipeta multicanal e pontas de pipeta filtradas, misture 10 microlitros da mistura de pentafosfato de guanosina com o lisado celular para uma incubação de cinco minutos em temperatura ambiente.

No final da incubação, lave uma ferramenta de pino 96X três vezes em uma solução de detergente não iônico a 0,01% por 30 segundos, seguido de 30 segundos de secagem em uma toalha de papel por lavagem, antes de colocar a ferramenta de pino na placa de amostra de 96 poços. Após 30 segundos, levante a ferramenta de pinos para cima e coloque-a diretamente para baixo em uma membrana de nitrocelulose por 30 segundos.

Após cinco minutos de secagem, coloque a membrana de nitrocelulose na pasta de plástico transparente para exposição da tela de fósforo de armazenamento e visualização por imagem de fósforo, conforme demonstrado.

Para quantificar e identificar proteínas-alvo potenciais no software de análise associado ao gerador de imagens de fósforo, abra o arquivo .gel das placas visualizadas.

Para definir os pontos a serem analisados, use a função "Análise de matriz" para configurar uma grade de 12 colunas por 8 linhas. Para circunscrever a borda externa de todos os pontos, defina círculos grandes. Exporte o "Volumn+Background" e a "Area" dos grandes círculos definidos para uma planilha, para circunscrever os pequenos pontos internos. Diminua o tamanho dos círculos definidos.

Exporte o "Volumn+Background" e a "Área" dos pequenos círculos definidos e salve todos os dados na planilha. Posicione os círculos para se sobreporem aos pontos conforme necessário, redimensionando para um pouco maiores do que os pontos reais.

Use a equação para calcular as frações de ligação na planilha e plotar os dados. Em seguida, identifique as proteínas de ligação potenciais nos poços que apresentam altas frações de ligação em comparação com a maioria dos outros poços.