Ação Capilar Radial Diferencial do Ensaio de Ligante: Uma Técnica de Alto Rendimento para Identificar Proteínas Intracelulares de Ligação ao Segundo Mensageiro de Nucleotídeos Bacterianos
Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Técnicas Biológicas
0 visualizações • 4:38 min. • July 8th, 2025
As bactérias produzem segundos mensageiros de nucleotídeos, NSMs - moléculas de sinalização intracelular - em resposta a estímulos apropriados. Essas moléculas se ligam a proteínas-alvo e regulam as funções bacterianas.
Para identificar essas proteínas-alvo usando a ação capilar radial diferencial do ensaio do ligante, pegue uma placa de vários poços com lisado de células bacterianas contendo proteínas solúveis. Essas proteínas são derivadas de diferentes clones bacterianos que expressam ORFs individuais - quadros de leitura abertos - no genoma, garantindo que cada poço tenha uma proteína distinta.
Adicione uma mistura de guanosina tetra e pentafosfatos - NSMs marcados com fósforo radioativo. Essas moléculas se ligam a proteínas-alvo no lisado. Com uma ferramenta de alfinetes, colete uma quantidade igual de líquido de cada poço. Coloque a ferramenta em uma membrana de nitrocelulose para depositar o líquido como manchas.
As proteínas-alvo se ligam à membrana por meio de interações não covalentes, impedindo sua difusão. Isso sequestra os NSMs radiomarcados ligados no ponto central de aplicação. Os NSMs livres difundem-se radialmente com a fase líquida por ação capilar.
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