Ensaio de imagem por sonda fluorescente: uma técnica para visualizar o estresse oxidativo nas células organoides intestinais cultivadas tratadas com indutor de espécies reativas de oxigênio

Os organoides intestinais recapitulam a organização cripta-vilosidade semelhante ao intestino, tendo um lúmen central composto por células mortas e detritos. O lúmen é revestido por células semelhantes a vilosidades e saliências semelhantes a criptas que abrigam células-tronco.

Diferentes células organoides produzem níveis variados de espécies reativas de oxigênio, ROS - subprodutos de atividades metabólicas, cujo acúmulo leva ao estresse oxidativo.

Para visualizar o estresse oxidativo em células variadas, comece pegando uma placa de vários poços contendo organoides 3D cultivados em uma matriz de embasamento. As células-tronco organoides expressam uma proteína de fluorescência verde ou proteína marcada com GFP que ajuda a distingui-las durante a imagem.

Suplementar os poços com hidroperóxido de terc-butilo - um indutor de ROS - e incubar. O indutor ativa a NADPH oxidase ligada à membrana e estimula a produção de ROS dentro das células. As células-tronco, sendo metabolicamente ativas, produzem mais ROS do que as células diferenciadas.

Adicione sondas fluorogênicas sensíveis a ROS. Essas sondas lipofílicas entram rapidamente nas células e reagem com ROS para produzir fluorescência ve