Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Técnicas Biológicas
0 visualizações • 5:00 min. • July 8th, 2025
Os neurotransmissores monoamina, mensageiros químicos endógenos, transmitem sinais através da sinapse, o ponto de contato entre os neurônios. O sistema de neurotransmissores monoamina rigidamente regulado é essencial para a função neuronal normal.
Para rastrear o efeito de uma droga de teste na liberação de monoamina ex vivo, obtenha fatias de tecido cerebral de rato contendo a região de interesse em um tampão oxigenado resfriado, mantendo a viabilidade do tecido.
Transfira as fatias de tecido para poços de uma placa de vários poços, com inserções de filtro porosas conectadas a um suprimento de mistura gasosa e compreendendo líquido cefalorraquidiano artificial oxigenado, aCSF, suplementado com inibidores da monoamina oxidase. Incubar.
Os inibidores se difundem nas células e inativam as enzimas monoamina oxidase, impedindo a degradação das monoaminas e aumentando sua concentração disponível para armazenamento e liberação.
Transfira as inserções contendo tecido para poços contendo aCSF oxigenado e o medicamento de teste. Incubar. A droga pode estimular o sistema neurotransmissor da monoamina, aumentando a concentração de monoamina no espaço extraneuronal, levando à sua liberação do tecido cerebral para a solução.
As monoaminas liberadas passam pelas inserções porosas nos poços, separando-se do tecido.
Após a incubação, remova as inserções contendo fatias de tecido. Recolher a solução de monoamina num tubo composto por um solvente compatível com a cromatografia líquida de alta resolução (HPLC). Transfira o conteúdo do tubo para unidades de filtro pré-montadas. Centrífuga, removendo os principais contaminantes.
Colocar o filtrado obtido na coluna de HPLC e efectuar uma cromatografia para determinar a concentração de monoamina, indicativa do efeito do fármaco de ensaio na libertação de monoamina.
Para induzir a liberação de monoamina, transfira as amostras de tecido para cada poço de uma câmara de efluxo de 48 poços feita sob medida, contendo 0,5 a 1 mililitro de tampão de efluxo por poço com borbulhamento constante e suave, e permita que as amostras se recuperem por 30 a 50 minutos a 37 graus Celsius.
Ao final do período de equilíbrio, mova o suporte de tecido com tecido cerebral, para poços contendo 500 microlitros de tampão de efluxo oxigenado com ou sem agente farmacológico, batendo o suporte na borda do poço para evitar a transferência mínima de tampão entre os poços, para uma incubação de 20 minutos a 37 graus Celsius.
Ao final da incubação, mova o suporte para um novo conjunto de poços contendo 500 microlitros de tampão de efluxo com ou sem o medicamento de interesse e retorne a placa à incubadora de cultura de células, por mais 20 minutos.
Durante a segunda incubação, transfira a solução dos poços da primeira incubação para tubos de microcentrífuga contendo 50 microlitros de ácido perclórico ou fosfórico 1 N no gelo e rotule os tubos # 1.
No final da segunda incubação, mova o suporte de tecido para poços vazios com a placa no gelo e transfira os sobrenadantes da segunda incubação para novos tubos de microcentrífuga contendo 50 microlitros de ácido perclórico ou fosfórico 1 N, no gelo. Rotule esses tubos #2.
Quando todos os sobrenadantes tiverem sido transferidos, adicione 1 mililitro de tampão de dissecção gelada a cada poço de tecido e use uma pinça pequena para transferir cada amostra de tecido para um novo tubo de microcentrífuga. Remova o tampão dos tubos de amostra e armazene os tecidos a -80 graus Celsius. Em seguida, transferir as soluções de incubação recolhidas para tubos filtrantes de microcentrífuga para centrifugação e colocar o filtrado no gelo, até à análise por HPLC.