Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Técnicas Biológicas
0 visualizações • 2:57 min. • July 8th, 2025
Para provocar uma resposta imune, os antígenos se ligam aos anticorpos específicos para os receptores endocíticos presentes na superfície das células dendríticas, ou DCs - as células apresentadoras de antígenos - que ajudam na captação de antígenos.
A formação de um complexo anticorpo-antígeno é uma etapa crucial e pode ser realizada in vitro acoplando quimicamente o antígeno a um anticorpo monoclonal direcionado a DC.
Para verificar a eficiência do processo de conjugação, comece com uma placa ELISA pré-revestida com os anticorpos capturados. Tratar a placa com uma solução de bloqueio para evitar a ligação não específica dos antigénios à superfície revestida.
Adicione conjugados anticorpo-antígeno quimicamente reticulados à placa e incuba. O epítopo específico do antígeno interage com o parátopo do anticorpo capturado formando um complexo anticorpo-antígeno-anticorpo.
Em seguida, cubra a placa com um terceiro conjunto de anticorpos ligados a uma enzima. Esses anticorpos se ligam especificamente aos anticorpos primários presentes no conjugado, permitindo sua detecção.
Adicione um tampão contendo o substrato cromogênico para visualizar os conjugados. A enzima ligada ao anticorpo reage com o substrato, gerando o produto colorido.
Trate a placa com uma solução de inativação acidificada, que inativa a enzima e termina a reação. Analisar a placa espectrofotometricamente. A presença de uma solução colorida verifica a presença de conjugados anticorpo-antígeno e confirma a conjugação bem-sucedida.
Para verificar o sucesso da conjugação por ELISA, revestir uma placa ELISA apropriada de 96 poços com 100 microlitros do anticorpo anti-OVA por poço e diluir em série o anti-DEC-205/OVA na proporção de 1:2 no tampão de bloqueio, para obter diluições de 6 microgramas por mililitro a 93,8 nanogramas por mililitro.
Adicione 100 microlitros de cada diluição aos poços apropriados da placa revestida com anticorpos para uma incubação de uma hora à temperatura ambiente. No final da incubação, adicione 100 microlitros de anticorpo conjugado com peroxidase de rábano contra o conjugado anti-DEC-205/OVA à placa para uma incubação de uma hora à temperatura ambiente.
Em seguida, adicione 50 microlitros de substrato de peroxidase de rábano a cada poço, para permitir a análise da reação de cor por espectrofotometria.