Por que o ELISA é usado para verificar a conjugação entre anticorpo e antígeno?

O ELISA confirma a conjugação bem-sucedida detectando a formação de complexos anticorpo-antígeno-anticorpo por meio de uma reação colorimétrica. Isso fornece uma leitura quantitativa e específica que distingue espécies conjugadas de não conjugadas. O método auxilia em decisões de prosseguir ou não no desenvolvimento do conjugado, verificando a acessibilidade do epítopo após a ligação.

Como a solução bloqueadora melhora a precisão do ELISA na verificação da conjugação?

O bloqueio evita a ligação inespecífica de conjugados anticorpo-antígeno à superfície da placa de ELISA, reduzindo o sinal de fundo. Isso garante que o sinal detectado reflita apenas a ligação específica entre o anticorpo capturado e o epítopo do antígeno. A especificidade aprimorada aumenta a confiabilidade na quantificação da eficiência de conjugação.

O que a análise espectrofotométrica mede neste protocolo de ELISA?

A espectrofotometria mede a absorbância do produto colorido gerado pela reação enzima-substrato, o que se correlaciona com a quantidade de anticorpo ligado à enzima. Isso fornece uma leitura quantitativa proporcional à concentração de conjugados anticorpo-antígeno em cada poço. Os dados permitem comparações entre séries de diluição para avaliar a eficiência de conjugação.

Por que a diluição seriada de conjugados anticorpo-antígeno é usada na verificação do ELISA?

A diluição seriada cria uma curva padrão para quantificar a eficiência de conjugação em uma faixa de concentrações, de alta a baixa. Isso permite aos pesquisadores determinar o limite de detecção e avaliar a sensibilidade do ensaio. A série de diluições possibilita a interpolação das concentrações de amostras desconhecidas e garante que os resultados estejam dentro da faixa dinâmica do ensaio.

Qual anticorpo ligado a enzima específico é usado para detecção neste ELISA?

Utiliza-se um anticorpo conjugado à peroxidase de rábano-picante contra o conjugado anti-DEC-205/OVA para detectar o anticorpo primário presente no complexo antígeno-anticorpo. Esse anticorpo ligado à enzima liga-se especificamente à região Fc ou ao idiótipo do anticorpo capturado no conjugado. A enzima peroxidase de rábano-picante catalisa então uma reação cromogênica, permitindo a detecção espectrofotométrica.

Ensaio de imunoabsorção enzimática para verificar conjugados anticorpo-antígeno quimicamente acoplados

JoVE Encyclopedia of Experiments

Técnicas Biológicas

0 vistas • 2:57 min • July 8th, 2025

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Para provocar uma resposta imune, os antígenos se ligam aos anticorpos específicos para os receptores endocíticos presentes na superfície das células dendríticas, ou DCs - as células apresentadoras de antígenos - que ajudam na captação de antígenos.

A formação de um complexo anticorpo-antígeno é uma etapa crucial e pode ser realizada in vitro acoplando quimicamente o antígeno a um anticorpo monoclonal direcionado a DC.

Para verificar a eficiência do processo de conjugação, comece com uma placa ELISA pré-revestida com os anticorpos capturados. Tratar a placa com uma solução de bloqueio para evitar a ligação não específica dos antigénios à superfície revestida.

Adicione conjugados anticorpo-antígeno quimicamente reticulados à placa e incuba. O epítopo específico do antígeno interage com o parátopo do anticorpo capturado formando um complexo anticorpo-antígeno-anticorpo.

Em seguida, cubra a placa com um terceiro conjunto de anticorpos ligados a uma enzima. Esses anticorpos se ligam especificamente aos anticorpos primários presentes no conjugado, permitindo sua detecção.

Adicione um tampão contendo o substrato cromogênico para visualizar os conjugados. A enzima ligada ao anticorpo reage com o substrato, gerando o produto colorido.

Trate a placa com uma solução de inativação acidificada, que inativa a enzima e termina a reação. Analisar a placa espectrofotometricamente. A presença de uma solução colorida verifica a presença de conjugados anticorpo-antígeno e confirma a conjugação bem-sucedida.

Para verificar o sucesso da conjugação por ELISA, revestir uma placa ELISA apropriada de 96 poços com 100 microlitros do anticorpo anti-OVA por poço e diluir em série o anti-DEC-205/OVA na proporção de 1:2 no tampão de bloqueio, para obter diluições de 6 microgramas por mililitro a 93,8 nanogramas por mililitro.

Adicione 100 microlitros de cada diluição aos poços apropriados da placa revestida com anticorpos para uma incubação de uma hora à temperatura ambiente. No final da incubação, adicione 100 microlitros de anticorpo conjugado com peroxidase de rábano contra o conjugado anti-DEC-205/OVA à placa para uma incubação de uma hora à temperatura ambiente.

Em seguida, adicione 50 microlitros de substrato de peroxidase de rábano a cada poço, para permitir a análise da reação de cor por espectrofotometria.