Ensaio de Western Blot Quimioluminescente para Processamento de Proteínas

O CD95 - um receptor de morte - liga-se a seus anticorpos agonísticos, desencadeando a montagem de um complexo de sinalização indutor de morte, ou DISC - um complexo multiproteico que recruta procaspase 8. No DISC, a procaspase 8 dimeriza e processa para formar vários produtos intermediários de clivagem e, finalmente, uma forma ativa que inicia a apoptose.

Para analisar o processamento da caspase-oito usando western blotting quimioluminescente, pegue um lisado contendo produtos de clivagem intermediários associados ao DISC da caspase 8 em um tubo. Complemente isso com anticorpos anti-CD95 capturados por esferas de proteína A-agarose. Os anticorpos anti-CD95 se ligam ao componente DISC ― CD95, formando complexos proteicos.

Carregue a amostra em um gel de poliacrilamida SDS para separar os intermediários da caspase 8 imunoprecipitada de diferentes tamanhos como bandas distintas. Coloque o gel em uma membrana de blotting e aplique uma corrente elétrica. Os intermediários da caspase 8 saem do gel para a membrana de blotting.

Trate a membrana com uma solução contendo proteínas de bloqueio para saturar os locais de ligação às proteínas - evitando ligações inespecíficas.

Adicione uma solução de anticorpos primários, que se ligam aos produtos da caspase-oito em um local específico.

Adicione anticorpos secundários marcados com enzimas que se ligam especificamente à região Fc complementar do anticorpo primário para formar um complexo de produto de clivagem caspase-oito - anticorpo primário - anticorpo secundário.

Adicione um substrato quimioluminescente que reaja com a enzima conjugada com anticorpos secundários e emita luz. A intensidade da luz emitida se correlaciona com a quantidade de produto de clivagem caspase-oito.

Para realizar o western blot, adicione 20 microlitros de buffer de carregamento 4X às contas e aqueça a 95 graus Celsius por 10 minutos. Simultaneamente, aqueça os controles de lisado a 95 graus Celsius por 5 minutos. Carregue os lisados, imunoprecipitantes e um padrão de proteína em um gel SDS a 12,5% e opere com uma tensão constante de 80 volts.

Após a conclusão da execução do gel, transfira as proteínas do gel SDS para uma membrana de nitrocelulose. Após a conclusão da transferência, coloque a membrana borrada em uma caixa e incube-a por uma hora em solução de bloqueio, sob agitação suave. Em seguida, lave a membrana três vezes por 5 minutos com PBST.

Para detectar as proteínas, adicione o primeiro anticorpo primário na diluição indicada à membrana e incube-o durante a noite a 4 graus Celsius com agitação suave. No dia seguinte, lave a membrana com três lavagens PBST de 5 minutos e, em seguida, incube a membrana com 20 mililitros de anticorpo secundário com agitação suave por 1 hora em temperatura ambiente.

Lave a membrana três vezes com PBST novamente. Depois de descartar a última lavagem de PBST, adicione aproximadamente 1 mililitro de substrato de peróxido de rábano à membrana e detecte o sinal quimioluminescente.