Digestão de proteínas na membrana para preparar proteínas co-imunoprecipitadas para estudos de interação

Para realizar a digestão na membrana, tome uma solução de complexos de proteínas co-imunoprecipitadas, cada um contendo uma proteína-alvo recombinante marcada com GFP associada à sua proteína parceira.

Transfira as proteínas para um tubo contendo um difluoreto de polivinilideno pré-úmido, membrana de PVDF e incube. A superfície hidrofílica da membrana de PVDF ajuda a transferir as proteínas para a membrana.

Transfira a membrana contendo proteínas para um tubo novo. Adicione um tampão contendo agente redutor para reduzir as ligações dissulfeto entre os resíduos de cisteína, levando à desnaturação das proteínas individuais nos complexos sem perturbar sua interação.

Substitua esta solução por um reagente alquilante, que alquila o grupo sulfidrila de ambas as proteínas nos complexos e evita a reforma das ligações dissulfeto. Lave a membrana para remover qualquer excesso de reagente.

Trate a membrana com um tampão contendo tripsina - uma enzima proteolítica. A tripsina cliva a proteína-alvo marcada com GFP e sua proteína parceira no terminal carboxila dos resíduos de arginina e lisina, liberando os peptídeos menores no sobrenadante. Transferir o sobrenadante para um novo tubo.

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