Digestão de proteínas na membrana para preparar proteínas co-imunoprecipitadas para estudos de interação

Para realizar a digestão na membrana, tome uma solução de complexos de proteínas co-imunoprecipitadas, cada um contendo uma proteína-alvo recombinante marcada com GFP associada à sua proteína parceira.

Transfira as proteínas para um tubo contendo um difluoreto de polivinilideno pré-úmido, membrana de PVDF e incube. A superfície hidrofílica da membrana de PVDF ajuda a transferir as proteínas para a membrana.

Transfira a membrana contendo proteínas para um tubo novo. Adicione um tampão contendo agente redutor para reduzir as ligações dissulfeto entre os resíduos de cisteína, levando à desnaturação das proteínas individuais nos complexos sem perturbar sua interação.

Substitua esta solução por um reagente alquilante, que alquila o grupo sulfidrila de ambas as proteínas nos complexos e evita a reforma das ligações dissulfeto. Lave a membrana para remover qualquer excesso de reagente.

Trate a membrana com um tampão contendo tripsina - uma enzima proteolítica. A tripsina cliva a proteína-alvo marcada com GFP e sua proteína parceira no terminal carboxila dos resíduos de arginina e lisina, liberando os peptídeos menores no sobrenadante. Transferir o sobrenadante para um novo tubo.

Lave a membrana com uma solução ácida, dissociando quaisquer peptídeos ligados da membrana, garantindo a extração completa. Puxe as frações contendo peptídeos em um único tubo. Dessecar por secagem a vácuo.

Ressuspender os resíduos em baixa concentração de ácido fórmico, dissolvendo os peptídeos, que estão prontos para a identificação da interação proteína-proteína.

Para preparar a membrana, corte as membranas de PVDF em pedaços de 3 milímetros por 3 milímetros usando uma tesoura cirúrgica que foi limpa imediatamente antes do uso. Coloque os pedaços de membrana em papel alumínio e adicione 2 a 5 microlitros de etanol a cada peça. Antes que as membranas estejam completamente secas, adicione 2 a 5 microlitros do eluente de proteína a cada peça e seque-as ao ar até que a superfície da membrana fique fosca.

Em seguida, transfira as membranas para tubos de 1,5 mililitro e armazene-as a 4 graus Celsius. Se usar imediatamente, adicione 2 a 30 microlitros de etanol, o que os tornará hidrofílicos. Remova o etanol com uma pipeta. Mas antes que as membranas sequem, adicione completamente 200 microlitros de solução de reação baseada em DTT a cada tubo e incube-os a 56 graus Celsius por uma hora.

Após a incubação, substitua a solução de reação por 300 microlitros de solução de iodoacetamida e incube no escuro por 45 minutos. Em seguida, lave as membranas duas vezes com água destilada e uma vez com acetonitrila a 2% por vórtice por pelo menos 10 segundos.

Trabalhar com ditiotreitol e acetonitrila pode ser extremamente perigoso. Uma máscara, óculos e luvas devem sempre ser usados ao realizar o procedimento de digestão na membrana.

Prepare a tripsina de acordo com as instruções do manuscrito e adicione 100 microlitros de solução de reação de tripsina a cada membrana. Incube durante a noite a 37 graus Celsius para digestão.

No dia seguinte, transfira a solução de reação para um tubo limpo de 1,5 mililitro e adicione 100 microlitros de soluções lavadas à membrana. Incube a membrana a 60 graus Celsius por duas horas.

Em seguida, recolha a solução lavada e misture-a com a solução de reação. Adicione mais 100 microlitros de solução lavada à membrana e sonice por 10 minutos. Em seguida, colete a solução lavada e misture-a com a solução de reação. Cubra o tubo de ensaio com um pedaço de filme de laboratório e faça pequenos furos no filme com uma agulha.

Seque a solução usando um concentrador a vácuo e dissolva o resíduo em 10 microlitros de ácido fórmico a 0,2%. Centrifugar o tubo a 12.000 x g durante três minutos e transferir o sobrenadante para um tubo de amostra.

Analise a amostra usando um espectrômetro de massa ligado a um sistema de HPLC nano-LC.