Ensaio de imunoprecipitação para estudar interações de receptores enzimáticos em células transfectadas

Morte programada-1, PD-1, uma proteína receptora de superfície celular, contém dois motivos citoplasmáticos de tirosina - o motivo inibitório, ITIM, e o motivo do interruptor, ITSM. A ligação do ligante induz a fosforilação ITIM e ITSM e o recrutamento da proteína tirosina fosfatase SHP2 para o domínio citoplasmático de PD-1, desencadeando uma cascata de sinalização a jusante.

Para estudar as interações SHP2-PD-1 por meio de um ensaio de co-imunoprecipitação, obtenha uma cultura de células epiteliais aderentes. Essas células expressam proteína fluorescente verde, PD-1 de tipo selvagem marcado com GFP com ITIM e ITSM fosforilados. Obtenha células epiteliais que expressam o mutante PD-1 marcado com GFP, em que as mutações ITIM ou ITSM inibem sua fosforilação.

Adicione tampão de lise contendo detergente e ortovanadato de sódio. Os detergentes lisam as células, causando a liberação da proteína PD-1 marcada com GFP. Os blocos de ortovanadato de sódio liberaram fosfatases, evitando assim a desfosforilação de ITIM e ITSM.

Centrifugar o lisado. Transferir o sobrenadante contendo proteínas para tubos novos. Adicione grânulos de agarose revestidos com anticorpos anti-GFP. As proteínas PD-1 m