Ensaio de imunoprecipitação para estudar interações de receptores enzimáticos em células transfectadas

Morte programada-1, PD-1, uma proteína receptora de superfície celular, contém dois motivos citoplasmáticos de tirosina - o motivo inibitório, ITIM, e o motivo do interruptor, ITSM. A ligação do ligante induz a fosforilação ITIM e ITSM e o recrutamento da proteína tirosina fosfatase SHP2 para o domínio citoplasmático de PD-1, desencadeando uma cascata de sinalização a jusante.

Para estudar as interações SHP2-PD-1 por meio de um ensaio de co-imunoprecipitação, obtenha uma cultura de células epiteliais aderentes. Essas células expressam proteína fluorescente verde, PD-1 de tipo selvagem marcado com GFP com ITIM e ITSM fosforilados. Obtenha células epiteliais que expressam o mutante PD-1 marcado com GFP, em que as mutações ITIM ou ITSM inibem sua fosforilação.

Adicione tampão de lise contendo detergente e ortovanadato de sódio. Os detergentes lisam as células, causando a liberação da proteína PD-1 marcada com GFP. Os blocos de ortovanadato de sódio liberaram fosfatases, evitando assim a desfosforilação de ITIM e ITSM.

Centrifugar o lisado. Transferir o sobrenadante contendo proteínas para tubos novos. Adicione grânulos de agarose revestidos com anticorpos anti-GFP. As proteínas PD-1 marcadas com GFP se ligam aos anticorpos anti-GFP.

Incubar com a suspensão SHP2. O PD-1-GFP ligado ao grânulo se liga ao SHP2 através do ITIM e ITSM fosforilados.

Adicione o tampão Laemmli e ferva para que os agentes redutores e detergentes no tampão desnaturem os complexos proteicos PD-1-GFP-SHP2. Centrifugar e recolher o sobrenadante que contém os complexos proteicos desnaturados. Execute SDS-PAGE e western blot.

O PD-1 do tipo selvagem e com mutação ITIM interage com SHP2. Os mutantes ITSM não conseguem se ligar a SHP2, indicando que a interação PD1-SHP2 requer ITSM fosforilado.

Durante a realização da imunoprecipitação, todas as etapas devem ser realizadas no gelo ou a 4 graus Celsius. Suplementar o tampão de lise com inibidores de protease dissolvendo um comprimido dos inibidores em 10 mililitros de tampão. Além disso, adicione 1 milimolar de ortovanadato de sódio ao tampão que será usado nas placas transfectadas PD1-GFP. Adicione 500 microlitros de tampão de lise gelada às células, certificando-se de adicionar o tampão de lise contendo o ortovanadato de sódio apenas às placas contendo células transfectadas com PD1-GFP.

Use um raspador de células para remover e coletar imediatamente as células das placas. Transfira os lisados para tubos frios de 1,5 mililitro e gire-os a 0,005 vezes g e a 4 graus Celsius por 30 minutos. Para coletar o sobrenadante pós-núcleo dos lisados, gire-os a 10.000 vezes g e 4 graus Celsius por 10 minutos.

Transferir os sobrenadantes para novos tubos e rejeitar o sedimento. Armazenar os sobrenadantes para o segundo conjunto de seis placas no gelo, para posterior análise do WCL.

Para começar a preparar as contas anti-GFP, agite suavemente o frasco que contém as contas antes de abrir para evitar que assentem. Remova 40 microlitros dos grânulos anti-GFP da pasta para cada condição. Centrifugue a 500 vezes g e 4 graus Celsius por 3 minutos. Remova o sobrenadante para lavar as contas, certificando-se de minimizar o contato entre a pipeta e as esferas para evitar perdas.

Ressuspenda os grânulos em 80 microlitros de tampão de lise por amostra. Adicione os grânulos lavados diretamente ao lisado celular das células que expressam PD1-GFP do primeiro conjunto de quatro placas. Gire a 0,005 vezes g por 30 minutos a 4 graus Celsius para imunoprecipitar as proteínas marcadas com GFP. Lave as esferas três vezes usando 1 mililitro de tampão de lise fria que não contenha ortovanadato para cada lavagem. Em seguida, centrifugue a 2.500 vezes g por 10 segundos.

Divida o lisado do SHP2 ativo do primeiro conjunto de placas em três porções iguais e adicione uma porção a cada um dos três tubos contendo os grânulos contendo PD1-GFP lavados. Adicione 1/3 do volume de lisado das células não transfectadas ao segundo tubo dos grânulos PD1-GFP do tipo selvagem. Descarte os 2/3 restantes.

Incube as esferas por 4 horas a 4 graus Celsius com rotação suave a 0,005 vezes g. Depois disso, lave as contas duas vezes, usando 1 mililitro de tampão de lise fria para cada lavagem. Adicione 80 microlitros de tampão de lise a cada amostra, garantindo que o volume total em cada tubo seja de 100 microlitros. Usando uma ponta de pipeta cortada, pipete suavemente para cima e para baixo para misturar. Em seguida, transfira 50 microlitros de cada tubo para dois tubos novos de 1,5 mililitro.

Primeiro, gire as contas a 2.000 vezes g e 4 graus Celsius por 30 segundos e remova o sobrenadante. Adicione 20 microlitros de tampão 2x Laemmli e ferva a 95 graus Celsius por cinco minutos. Usando um kit BCA, meça a concentração de proteína dos controles de entrada.

Transfira 30 microlitros da amostra mais diluída para um novo tubo. Use tampão de lise para diluir o restante dos controles de entrada para a mesma concentração da amostra mais diluída. Em seguida, transfira 30 microlitros de cada um dos controles de entrada diluídos para um novo tubo. Adicione volumes iguais de tampão 2x Laemmli aos lisados e ferva-os a 95 graus Celsius por cinco minutos.

Depois disso, gire as contas a 2.000 vezes g e 4 graus Celsius por 30 segundos antes de realizar a análise de Western blot conforme descrito no protocolo de texto.