Espectroscopia de Flutuação de Fluorescência para Estudar a Homo-Oligomerização de Proteínas

A espectroscopia de flutuação de fluorescência pode determinar o estado de oligomerização das proteínas em uma amostra.

Para começar, pegue uma lâmina com câmara contendo uma solução de monômero de proteína marcada com fluorescência. Coloque a lâmina sob um microscópio confocal. Concentre o feixe de laser em uma pequena parte da amostra - o volume confocal - para excitar os monômeros de proteína.

As moléculas de proteína se difundem para dentro e para fora do volume confocal devido ao movimento browniano. Esse movimento causa mudanças rápidas na intensidade da fluorescência, levando a flutuações na intensidade da fluorescência ao longo do tempo.

Adicione o agente dimerizante - um ligante bivalente que ajuda dois monômeros de proteína a se ligarem e, assim, formar um dímero. Devido à dimerização, dois rótulos fluorescentes se unem para formar uma única partícula, o que aumenta a intensidade de fluorescência por partícula - o brilho molecular.

O aumento do brilho molecular devido à dimerização aumenta a amplitude das flutuações de fluorescência - à medida que dois marcadores fluorescentes entram e saem do volume confocal juntos.

Obtenha imagens do volume confocal ao longo do tempo antes e depois da adição do agente dimerizante.

Calcule o brilho dos pixels individuais nas imagens confocais e obtenha a curva de brilho médio ao longo do tempo.

A adição do agente dimerizante resulta em um aumento de duas vezes no brilho devido aos sinais de fluorescência dupla de cada partícula, enquanto o número total de moléculas de proteína permanece o mesmo - indicando a formação de dímeros.

Para configurar a matriz de placas multipoços, primeiro prepare uma solução de FKBP12 purificado com 100 nanomolares no mesmo tampão usado para cromatografia de exclusão de tamanho. Sonicar e centrifugar com uma centrifugação rápida de 13.000 RPM para evitar a formação de agregados.

Agora, pipete de 100 a 200 microlitros da proteína diluída em uma câmara de observação de 8 poços com fundo de vidro. Adicione o dímero BB às concentrações finais de 10, 20, 40, 80, 100, 150, 300 e 500 nanomolares. Como referência, prepare uma solução de 100 nanomolares mVênus sozinho para avaliar os efeitos potenciais de agregação e precipitação e para recuperar um valor de brilho para o monômero com as mesmas configurações de aquisição.

Qualquer sistema confocal de microscópio de varredura de luz equipado com detectores digitais ou detectores analógicos bem caracterizados e capaz de manter um tempo de permanência constante para cada pixel adquirido pode ser usado. Selecione a objetiva de imersão em água de correção de colar projetada para espectroscopia de correlação de fluorescência.

Agora adicione uma gota de água à objetiva de imersão em água de correção do colarinho. Monte a câmara de observação de 8 poços no palco. Defina o caminho do feixe de excitação ligando o laser de 514 nanômetros e configurando-o para uma potência de 20 a 100 nanowatts na saída da objetiva. Ligue um detector HyD. Detectores capazes de contagem de fótons são preferíveis. Selecione a janela de emissão de 520 a 560 nanômetros.

Para o modo de aquisição, use 16 por 16 pixels.

Defina o tempo de permanência do pixel de forma que o tempo do quadro seja maior que a difusão da proteína e o tempo de permanência do pixel seja muito menor. Isso correspondeu a definir o tempo de permanência para aproximadamente 13 microssegundos para o sistema usado nesta demonstração.

Defina o orifício em uma unidade Airy para a emissão correspondente de aproximadamente 545 nanômetros. Selecione o modo de aquisição de tempo xy e selecione o número de quadros a serem adquiridos por aquisição e poço. Agora, defina o tamanho do pixel em aproximadamente 120 nanômetros.

Se o sistema estiver equipado com o modo de alto rendimento, introduza as coordenadas de cada poço e o número de aquisições por poço para automatizar o processo. Se o sistema estiver equipado com um sistema de perfusão, carregue a solução BB e programe a perfusão para começar logo após o 5.000º quadro para avaliar a cinética de dimerização enquanto adquire 10.000 imagens.

Selecione o poço correto e concentre-se na solução. Em seguida, inicie a aquisição e salve a pilha de imagens resultante no formato TIFF.