Ensaio Híbrido Levedura-Um Modificado para Detectar Interações Complexo de Proteína Heteromérica e DNA

Para detectar interações entre complexos de proteínas heteroméricas envolvendo várias proteínas com DNA alvo usando o ensaio de um híbrido de levedura modificado, pegue uma placa de vários poços contendo a concentração desejada de uma cultura de células de levedura transformada em crescimento ativo.

Essas células contêm uma sequência de DNA específica a montante do gene repórter β-codificador da galactosidase, impulsionada pelo promotor GAL-4, embora não tenha a proteína endógena do fator de transcrição GAL-4. As células expressam uma proteína-alvo fundida ao domínio de ativação GAL-4 e outra proteína sem o domínio de ligação ao DNA GAL-4.

Se essas proteínas interagirem, elas podem formar um complexo, permitindo que a proteína-alvo se ligue à sequência de DNA a montante na região promotora do gene repórter. O domínio de ativação GAL-4 ativa a expressão da enzima repórter β-galactosidase.

centrifuga. Ressuspenda as células em um tampão adequado. Congele e descongele as células para lisá-las e liberar β-galactosidase. Adicione beta-mercaptoetanol e um tampão contendo substrato de β-galactosidase.

O beta-mercaptoetanol estabiliza a enzima β-galactosidase. A β-galactosidase hidrolisa o