Ensaio Híbrido Levedura-Um Modificado para Detectar Interações Complexo de Proteína Heteromérica e DNA

Para detectar interações entre complexos de proteínas heteroméricas envolvendo várias proteínas com DNA alvo usando o ensaio de um híbrido de levedura modificado, pegue uma placa de vários poços contendo a concentração desejada de uma cultura de células de levedura transformada em crescimento ativo.

Essas células contêm uma sequência de DNA específica a montante do gene repórter β-codificador da galactosidase, impulsionada pelo promotor GAL-4, embora não tenha a proteína endógena do fator de transcrição GAL-4. As células expressam uma proteína-alvo fundida ao domínio de ativação GAL-4 e outra proteína sem o domínio de ligação ao DNA GAL-4.

Se essas proteínas interagirem, elas podem formar um complexo, permitindo que a proteína-alvo se ligue à sequência de DNA a montante na região promotora do gene repórter. O domínio de ativação GAL-4 ativa a expressão da enzima repórter β-galactosidase.

centrifuga. Ressuspenda as células em um tampão adequado. Congele e descongele as células para lisá-las e liberar β-galactosidase. Adicione beta-mercaptoetanol e um tampão contendo substrato de β-galactosidase.

O beta-mercaptoetanol estabiliza a enzima β-galactosidase. A β-galactosidase hidrolisa o substrato da β-galactosidase, formando um cromógeno amarelo.

Adicione solução de carbonato de sódio para desnaturar a β-galactosidase e interromper a reação. Centrifuga. Transferir o sobrenadante contendo o cromógeno amarelo para uma placa de vários poços. Usando um leitor de placas, meça a densidade óptica da solução em um comprimento de onda adequado para calcular a atividade da β-galactosidase.

Maior atividade de β-galactosidase indica interações positivas entre as proteínas e a sequência de DNA alvo, o que leva à expressão de β-galactosidase.

Ressuspenda a cultura e transfira 125 microlitros de cada poço para uma placa de espectrofotômetro. Meça a densidade óptica em 600 nanômetros para garantir que esteja entre 0,3 e 0,6. Centrifugue as células restantes no bloco de poço profundo a 3.000 vezes g e 21 graus Celsius por 10 minutos. Remover o sobrenadante invertendo.

Adicione 200 microlitros de tampão Z a cada poço e vórtice. Centrifugue a 3.000 vezes g e 21 graus Celsius por 5 minutos. Remover o sobrenadante invertendo. Adicione 20 microlitros de tampão Z a cada poço e vórtice. Cubra a placa com papel alumínio resistente aos ciclos de congelamento e descongelamento.

Em uma capela de exaustão, execute quatro ciclos de congelamento e descongelamento usando nitrogênio líquido em um banho-maria de 42 graus Celsius. Adicione 200 microlitros de solução recém-preparada de tampão Z/beta-mercaptoetanol/ONPG a cada poço. Incube a 30 graus Celsius por 17 a 24 horas ou até que a cor se desenvolva. Verifique se a cor se desenvolveu.

Adicione 110 microlitros de carbonato de sódio 1 molar a cada poço para interromper a reação. Registre a hora e vortex a placa. Centrifugue a 3.000 vezes g e 21 graus Celsius por 10 minutos. Use uma pipeta multicanal para transferir 125 microlitros de sobrenadante de cada poço para uma placa de espectrofotômetro. Meça a densidade óptica em 420 nanômetros.