Ensaio de ligação in vitro baseado em SELEX para identificar interações RNA-proteína

A evolução sistemática de ligantes por enriquecimento exponencial, SELEX, permite a identificação de sequências de RNA de ligação a proteínas.

Primeiro, obtenha um pool de RNA randomizado contendo RNAs radiomarcados com sequências aleatórias que se dobram em estruturas altamente específicas. Incubar com a proteína alvo. A proteína se liga a moléculas de RNA com sequências específicas e estruturas tridimensionais, enquanto os RNAs não específicos permanecem não ligados.

Passe a mistura por um filtro de nitrocelulose. O RNA não ligado passa pelos poros do filtro, enquanto os complexos RNA-proteína permanecem retidos.

Corte o filtro contendo complexo de RNA-proteína em fragmentos. Repita a interação RNA-proteína incubando o pool de RNA com concentração reduzida de proteína-alvo - permitindo apenas a ligação de sequências de alta afinidade, enquanto as sequências de baixa afinidade não se ligam.

Carregue esta mistura em um gel de poliacrilamida e faça eletroforese. Os complexos RNA-proteína migram lentamente através do gel em comparação com RNAs não ligados de baixa afinidade. A imagem de gel de raios-X mostra um deslocamento de banda correspondente à localização do complexo RNA-proteína.

Corte a porção de gel contendo complexo. Adicione a Proteinase K aos fragmentos de filtro e fatias de gel, digerindo as proteínas e liberando RNA do complexo. Adicione fenol-clorofórmio e centrifugue, separando o RNA das proteínas digeridas.

Misturar o sobrenadante contendo ARN com acetato de sódio e etanol. Centrifugue para precipitar o RNA. Ressuspender em água sem RNase. Transcreva o RNA para DNA complementar e amplifice o DNA por PCR.

Repita várias rodadas de separação baseada em filtro e gel para obter um conjunto de sequências de DNA específicas da proteína alvo.

Para ligar proteína e RNA em um volume de reação de 100 microlitros, primeiro prepare 10 tris-cloridrato milimolar em pH 7,5, contendo 50 milimolares de cloreto de potássio, um milimolar DTT, 0,09 microgramas por microlitro de albumina de soro bovino, 0,5 unidades por microlitro de RNAsina, 0,15 microgramas por microlitro de tRNA e 1 milimolar de EDTA. Em seguida, adicione 30 microlitros de proteína recombinante PTB e 10 microlitros de RNA do pool apropriado.

Coloque os tubos contendo as reações de ligação em um bloco de temperatura por cerca de 30 minutos a 25 graus Celsius. Em seguida, fracione o RNA ligado do RNA não ligado por meio de quatro rodadas de seleção e amplificação. Primeiro, filtre a amostra de 100 microlitros à temperatura ambiente através de um filtro de nitrocelulose conectado a um coletor de vácuo. O complexo RNA-proteína permanece no filtro.

Com uma lâmina de barbear estéril, corte o filtro em fragmentos e insira-os em um tubo de centrífuga. Mergulhe os pedaços de filtro em tampão de proteinase K e coloque-o em um copo por no mínimo três horas ou durante a noite para recuperar o RNA.

Para desproteinizar a amostra de RNA, adicione um volume igual de fenol-clorofórmio, vórtice. E então centrifugue em alta velocidade por cinco minutos em temperatura ambiente. Obter a fase aquosa e extrair novamente com clorofórmio. Em seguida, misturar o sobrenadante com 1/10 do volume de acetato de sódio 3 molar a pH 5,2 e dois a três volumes de etanol absoluto.

Deixe o tubo em um freezer de -80 graus Celsius por 30 minutos e centrifugue-o em alta velocidade por 10 minutos. Repita as etapas de lavagem e secagem com etanol a 70% e solubilize o RNA em água tratada com DEPC. Após a primeira rodada do ensaio de ligação do filtro, realizar mais três rodadas.

Em seguida, execute duas rodadas de transcrição, ligação e amplificação para separar as frações de RNA ligadas à proteína das frações não ligadas. Pré-moldado um gel nativo de poliacrilamida a 5% com uma proporção de 60 para 1 acrilamida bisacrilamida em tampão TBE de 0,5x. Em seguida, configure a reação de ligação RNA-proteína.

Coloque o gel em um dispositivo de eletroforese preenchido com tampão TBE 0,5x em uma câmara fria a 4 graus Celsius. Aplique 250 volts por 15 minutos e pipete a reação de ligação em diferentes poços. Em seguida, fracione o RNA ligado do RNA não ligado executando a eletroforese a 250 volts por uma a duas horas.

Em seguida, exponha o gel a um filme de raios-X e identifique a localização do RNA ligado usando autorradiografia. Corte a fatia de gel com o RNA ligado e insira-a em um tubo. Esmague a fatia de gel e incube no tampão proteinase K por três horas ou durante a noite. Repita a extração com fenol-clorofórmio e clorofórmio, conforme descrito anteriormente. Sintetize o cDNA a partir do RNA dissolvido.

Prepare 20 microlitros de reação, incluindo dois microlitros de tampão RT 10x, dois microlitros de transcriptase reversa AMV, 1 microlitro de primer reverso, 5 microlitros de água e 10 microlitros do RNA dissolvido. Incube a 42 graus Celsius por 60 minutos.

Amplifique o cDNA usando 20 a 25 ciclos de PCR, conforme descrito anteriormente. Repita o processo de síntese de RNA, ligação a proteínas e separação de frações ligadas e não ligadas a proteínas.