Microscopia de folha de luz treliçada para visualizar interações receptor-ligante em células vivas

A microscopia de folha de luz de rede, LLSM, permite a visualização das interações receptor-ligante da superfície celular em células vivas com alta resolução espaço-temporal.

Pegue uma lamínula contendo células que expressam ligantes transduzidas emitindo fluorescência vermelha. Prenda a lamínula com a célula voltada para cima em um porta-amostras lubrificado. Fixe o suporte no piezo de uma platina de microscópio para permitir o posicionamento preciso da amostra e a varredura durante a geração de imagens. Ajuste as configurações do software para focar em uma única célula que expressa o ligante.

Pipetar a suspensão de células que exprimem o recetor para a lamínula. Os receptores são marcados com anticorpos verdes marcados com fluoróforo. Visualize os pares de células em interação.

O laser de excitação do microscópio emite um feixe de laser circular polarizado linearmente que passa por lentes cilíndricas para criar uma folha de luz. A folha de luz é projetada em um modulador que remove o excesso de difração e o transforma em um padrão de treliça ultrafino.

A folha de luz treliçada ilumina uma seção ultrafina do par de células em interação, e a fluorescência emitida pelas células em interação é capturada perpendicularmente ao feixe incidente. Visualize o par de células em interação em vários planos Z e capture imagens bidimensionais em cada plano focal com uma câmera de alta velocidade.

Usando um software adequado, combine essas imagens para formar uma pilha z - uma imagem quadridimensional de alta resolução que demonstra a dinâmica espaço-temporal da interação receptor-ligante da superfície celular.

Adicione 10 mililitros de água e 30 microlitros de fluoresceína ao banho LLSM. Primeiro, pressione Imagem (Início) para mover o objeto para a posição da imagem e observe um padrão de feixe de laser de vaso único.

Alinhe o feixe de laser usando a guia e a região de interesse predefinida para criar um padrão fino que seja equilibrado em todas as direções. O feixe também deve aparecer focado na câmera localizadora. Use os dois ajustadores de inclinação do espelho, o micrômetro de foco superior e a cor da objetiva para ajustar o feixe.

Em seguida, lave o banho e as objetivas com pelo menos 200 mililitros de água para remover completamente qualquer fluoresceína.

Para criar imagens de esferas fluorescentes padrão, ative o pontilhamento definindo como 3 na caixa 'X Galvo Range' e pressione Live para view campo atual. Ajuste manualmente o espelho de inclinação, a cor da objetiva e o micrômetro de foco para obter os valores de cinza mais altos. Em seguida, ajuste conforme necessário para obter padrões adequados para os modos de captura de varredura objetiva, Z galvo, Z mais objetiva e varredura de amostra. Depois disso, pressione Executar no modo de varredura de amostra para coletar a função de propagação do ponto de amostragem para desinclinação e desconvolução. Altere os lasers para o modo de três cores e pressione Executar novamente.

Para começar, adicione 100.000 células apresentadoras de antígenos à lamínula circular de 5 milímetros de diâmetro preparada e deixe-as assentar por 10 minutos. Lubrifique o porta-amostras e adicione a lamínula com o lado da célula para cima.

Em seguida, adicione uma gota de mídia de imagem na parte de trás da lamínula. Aparafuse o suporte de amostra no piezo e pressione Imagem (Início). Encontre uma célula apresentadora de antígeno para obter imagens e certifique-se de que o LLSM e o software de imagem estejam funcionando corretamente.

Pressione Ao vivo para view a imagem atual. Mova-se ao longo de Z para encontrar a lamínula e as células. Encontre o centro de uma célula apresentadora de antígeno movendo-se na direção Z e, em seguida, pressione Parar para pausar o laser. Verifique 3D e insira as configurações desejadas. Pressione Enter e, em seguida, pressione Executar para coletar os dados.

Abaixe o estágio para a posição Carga e adicione 50 microlitros de células T em meios de imagem gota a gota, diretamente sobre a lamínula. É melhor deixar uma gota se formar na extremidade da ponta da pipeta e, em seguida, tocar a ponta no líquido do banho. Levante o palco para trás clicando em Imagem (Retorno).

Comece a criar imagens. Certifique-se de definir a pilha Z desejada e o comprimento do lapso de tempo. Por exemplo, crie uma imagem de 60 pilhas Z em um tamanho de passo de 0,4 micrômetro e insira quadros de tempo de 500. Pare a gravação antes de atingir 500 quadros para evitar fotobranqueamento. Use o modo Live para procurar pares de células e, quando as configurações prontas e desejadas forem inseridas, pressione Executar para coletar dados.