Microscopia de campo escuro para visualizar a dinâmica difusional de nanobastões na membrana celular

Para investigar a dinâmica de difusão de nanobastões de ouro em uma membrana de células vivas usando microscopia de campo escuro, DFM, combinado com rastreamento de partícula única, comece com uma lamínula esterilizada em uma placa de cultura contendo meio adequado. Adicione a suspensão da célula na lamínula. O meio facilita o crescimento celular.

Incube com nanobastões de ouro carregados positivamente que adsorvem na membrana celular carregada negativamente por meio de interações eletrostáticas. Pipete o meio do prato para a ranhura de uma lâmina de vidro. Coloque a lamínula com o lado da célula voltado para baixo na ranhura e sele.

Coloque a lâmina na platina do microscópio de campo escuro. O microscópio ilumina a amostra com uma luz oblíqua de alto ângulo que passa por um condensador de campo escuro especializado.

Após a iluminação dos nanobastões, os elétrons livres na superfície do nanobastões oscilam em uma frequência ressonante com a luz incidente. Os elétrons oscilantes espalham a luz em um comprimento de onda específico capturado pela lente objetiva, permitindo a visualização de nanobastões.

Da mesma forma, a membrana celular - composta de lipídios e proteínas - espalha a luz incidente com um índice de refração mais alto do que o meio circundante, criando uma imagem brilhante contra um fundo escuro. Capture imagens DFM de séries temporais.

Usando um software adequado, realize a análise de rastreamento de partícula única nas imagens DFM para visualizar a difusão dos nanobastões através da membrana celular com alta resolução espaço-temporal.

Comece queimando uma lamínula de vidro embebida em etanol na chama e colocando a lamínula em uma placa de cultura de células de 35 por 10 milímetros contendo 2 mililitros de meio de cultura de células sem vermelho de fenol. Adicione 50 microlitros da suspensão celular de interesse na lamínula e agite suavemente o prato para frente e para trás e para a esquerda e para a direita para distribuir uniformemente as células.

Coloque a placa na incubadora de cultura de células por aproximadamente 12 horas até que as células atinjam 20% a 40% de confluência antes de adicionar 20 microlitros de nanobastões de ouro revestidos com CTAB à placa. Depois de agitar suavemente para dispersar os nanobastões uniformemente pelo prato, coloque-o em uma atmosfera umidificada por 5 minutos.

No final da incubação, transfira lentamente 100 microlitros de sobrenadante do prato para a ranhura de uma lâmina de vidro e coloque cuidadosamente a lamínula com o lado da célula voltado para baixo na ranhura da lâmina. Em seguida, sele a borda da lamínula com esmalte e deixe o esmalte secar antes de colocar a lâmina no microscópio de campo escuro stage.

Para rastreamento de partícula única por microscopia de campo escuro, coloque uma gota de óleo no condensador de campo escuro imerso em óleo e gire o botão até que o condensador entre em contato com a lâmina de vidro. Coloque uma gota de óleo na parte superior da lamínula e gire o botão de foco até que a objetiva de imersão em óleo de 60x toque o óleo.

Ligue a fonte de luz e gire levemente o botão de foco para focar o plano de imagem. Em seguida, clique no ícone da câmera no software do microscópio para registrar uma série temporal de imagem de luz de dispersão de amostra usando a câmera CMOS colorida e salve a imagem em um formato TIFF.

Para extrair uma única trajetória de longo prazo, abra a imagem no ImageJ e clique em Imagem | Tipo | e 8 bits para converter a imagem do modo RGB para o modo de 8 bits. Para ajustar o contraste, clique em Imagem | Ajustar | Brilho | Contraste e defina os parâmetros. Selecione uma partícula alvo e use "Control + X" para cortar o plano de fundo da série temporal.

Clique em Plug-ins | Particle Tracker Classic | e Particle Tracker para abrir a janela de detecção e vinculação de partículas e definir o raio como 6, o corte como 0 e o percentil como 0,01%. Defina o intervalo de vínculos como 10 e o deslocamento como 10 e clique em "OK" para abrir a janela de resultados do rastreador de partículas para ver os resultados.

Clique em "Visualizar todas as trajetórias" para inspecionar as trajetórias geradas. Se a trajetória gerada por software e a trajetória em movimento dos nanobastões de ouro forem compatíveis, clique em "Salvar relatório completo" para salvar os resultados. Se a trajetória gerada por software não corresponder à trajetória em movimento dos nanobastões de ouro, clique em "Revincular partículas" para revincular as partículas detectadas com diferentes parâmetros de faixa de link e percentil.